3.3.1. Đối tượng
Vi khuẩnSalmonella đa kháng thuốc phânlập được từ thịt lợn, gà tươi bị nhiễm được bày bán lẻ ở một số địa điểm tại Hà Nội
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu * Môi trường, hóa chất * Môi trường, hóa chất
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (của hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm:
- Môi trường BPW, Muller Kauffmann, MSRV, thạch XLT4, thạch Rambach dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
- Môi trườngKligler, Lysine decarboxylase broth (LDC), Ureaza broth, thạch nghiêng Simmoncitrate dùng để thử phản ứng sinh hóa vi khuẩn
Salmonella
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn
- Các loại đường: glucoza, lactoza
- Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
* Kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella
Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella
* Hóa chất, mồi dùng cho phản ứng RT-PCR
- Mồi, taq-DNA polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, đệm điện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm điện di (gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide), các hóa chất sinh học phân tử khác…dùng cho RT-PCR
* Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm bao gồm:
Đĩa petri, lam kính, ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, ống hút, que cấy, đèn cồn, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, lò vi sóng, kính hiển vi…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella bằng các môi trường đặc hiệu, kiểm tra các đặc tính sinh hóa đặc trưng.
- Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella
phân lập được.
- Định typ chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng sinh trong đó có kháng cả với tetracycline và chloramphenicol.
- Phát hiện và đánh giá một số gen kháng thuốc của chủng Salmonella đa kháng thuốc phân lập được.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp.
Salmonella spp. nuôi cấy và phân lập theo tiêu chuẩn ISO 6579-2005,
Hình 3.1. Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579-2005
Các chủngSalmonella spp. dương tính được giữ giống trên môi trường BHI có bổ sung glyxerin, bảo quản ở -200C.
3.5.2. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh
Các chủng Salmonella phân lập được thử khả năng mẫn cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thử tính mẫn cảm kháng sinh với 10 loại kháng sinh bao gồm: streptomycine,
Mẫu 25g
Môi trường Buffered Pepton Water (225ml) ở 370C/24h
Môi trường thạch MRSV ở 41,50C/24-48h
Môi trường Muler Kaufman ở 370C/18-24h
Ria cấy trên thạch Rambach ở 370C/24h. Khuẩn lạc màu
hồng cánh sen, rìa gọn
Ria cấy trên thạch XLT4 ở 370C/24h. Khuẩn lạc màu đen, bóng, rìa gọn
Ria cấy và cấy chích sâu trên thạch nghiêng Kligler
Phản ứng sinh hóa Lysine (+) Ureaza (-) Simoncitrat (+) Lactoza (-) Glucoza (+) H2S (+) 20 giọt 1 ml Chọn khuẩn lạc đặc trưng
ampicillin, cephalothin, chloramphenicol, amoxicillin, gentamycin, tetracycline, ciprofloxacin, ceftazidine, trimethoprime/sulfamethoxazol.
Các chủng Salmonella phân lập được cấy chuyển từ các đĩa thạch dinh dưỡng sang môi trường Muller Hinton agar, sử dụng các khoanh giấy kháng sinh đặt lên trên đĩa thạch, nuôi cấy ở 37oC/24h. Đo đường kính của vòng vô khuẩn và so sánh với tiêu chuẩn đánh giá của CLSI (2011) (Các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm Hoa Kỳ - Clinical Laboratory Standards Instittute).
Bảng 3.1. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩnvới một số loại kháng sinh
TT Loại kháng sinh Hàm lượng
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
S I R 1 Amoxicillin 20 µg ≥ 18 14 - 17 ≤ 13 2 Ampicillin 10 µg ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 3 Cephalothin 30 µg ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 4 Ceftazidine 30 µg ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 5 Chloramphenicol 30 µg ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 6 Ciprofloxacin 5 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 7 Gentamycin 10 µg ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 8 Streptomycine 10 µg ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 9 Tetracycline 30 µg ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 10 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg ≥ 16 11 - 15 ≤ 10
3.5.3. Phương pháp định typ bằng phản ứng huyết thanh học
Tiến hành định typ chủng vi khuẩn Salmonellađa kháng thuốc trong đó có 2 loại kháng sinh chloramphenicol và tetracyclinebằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm với kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản). Trên cơ sở kết quả thu được, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại (Kauffmann and White Popoff, 2001)
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellatừ môi trường đặc hiệu (XLT4 hoặc Rambach), ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, bồi dưỡng 370C qua đêm.
* Tiến hành
- Đinh type kháng nguyên O
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh polyvalent O (20 µl) lên phiến kính
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellađã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính.
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
• Quan sát:
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti.
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm và đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC,... tương tự kháng huyết thanh poly O. Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh O đơn giá.
Ví dụ: OMA dương tính, tiếp tự với kháng huyết thanh đa giá O 3,10,15; O 9; O4,5, Nếu O 3,10,15 dương tính, tiếp tục với huyết thanh đơn giá O 3, O 10, O15.
-Đinh type kháng nguyên H
Nhiều chủng Salmonellacó 2 pha kháng nguyên H. Tuy nhiên ở vi khuẩn
ức chế sự xuất hiện của pha1 bằng cách nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh ức chế pha 1 vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H.
Pha 2:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: Đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dùng đĩa petri có đường kính 9mm. Trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ kháng huyết thanh Sven Gard với mục đích ức chế pha 1. Tuỳ theo pha 1 mà có loại kháng huyết thanh Sven Gard khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6) SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10 SG2: ức chế Hd, Hi, He,h SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26 SG4: ức chế Hr, Hz SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15 Sg6: ức chế H1,2, H1,5, H1,6, H1,7, Hz6
- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở vị trí giữa đĩa thạch Sven Gard.
- Bồi dưỡng 370C/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1.
3.5.4. Phương pháp xác định một số gen kháng sinh của chủng Salmonella đa kháng bằng phương pháp RT-PCR đa kháng bằng phương pháp RT-PCR
• Tách chiết RNA tổng số
Các chủng vi khuẩn Salmonella được lựa chọn sau khi định typ nuôi cấy lại trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient agar. Tăng sinh trong môi trường BHI để thu được canh khuẩn đạt nồng độ 108 để tách RNA.
-Lấy 1,5 ml canh khuẩn cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 14000 vòng/ phút trong 10 phút. Đổ phần dung dịch, thu cặn vi khuẩn ở đáy ống
-Bổ sung400µl trizol.Siêu âm từ 20amp – 60 amp/ 30 giây để phá màng tế bào
-Bổ sung 200µl chloroform vào mỗi eppendorf, lắc trộn đều
-Ly tâm 14000 vòng/10 phút/40C. Hút dịch nổi phía trên cho vào eppendorf mới
-Bổ sung 200µl chloroform, lắc trộn đều, ly tâm 14000 vòng/10 phút/40C -Hút dịch nổi phía trên sang eppendorf mới, tiếp tục bổ sung một lượng tương đương isopropanol, đảo nhẹ. Ủ ở -200C trong 3 giờ.
-Thu mẫu: ly tâm 14000 vòng/10 phút/40C
-Đổ hết dịch bên trên đi, rửa tủa bằng ethanol 70% pha trong DEPC-DW. Rửa vòng quanh 3 lần. Úp ngược xuống giấy thấm sạch, để khô tự nhiên.
-Bổ sung 70µl DEPC- DW mỗi eppendorf, búng nhẹ để làm tan hoàn toàn cặn.
-Mẫu RNA tổng số được bảo quản ở -800C cho thí nghiệm tiếp theo.
• Tổng hợp cDNA
5x buffer 4 µl/ mẫu
0,1M DTT 2 µl/ mẫu
dNTPs 2 µl/ mẫu
Random primer 2 µl/ mẫu
RNase inhibitor 0,5 µl/ mẫu
mMLV-RT 1 µl/ mẫu
11,5 µl/ mẫu
+ Mix đều rồi ủ hỗn hợp ở 750C/5 phút. Sau đó chia vào eppendorf có sẵn 8,5µl RNA tổng số (đã được hiệu chỉnh về nồng độ 1 µg/ µl).
+ Lắc trộn đều, ly tâm nhẹ, rồi ủ ở 370C trong 1 giờ.
+ Tiếp tục đun sôi ở 950C trong 5 phút. Sau đó đặt ngay vào đá 5 phút. + Bảo quản ở -200C.
• Mồi (primer)
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định gen kháng thuốc của chủng Salmonella đa kháng thuốc dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả: Ma et al.(2007); Zhao et al. (2001).
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu xác định gen kháng kháng sinh Nhóm kháng
sinh Gen
Ký hiệu
mồi Trình tự nucleotide của mồi 5’ – 3’
Sản phẩm (bp) Tetracyclines TetA TetA- F TetA- R TTGGCATTCTGCATTCACTC GTATAGCTTGCCGGAAGTCG 494 TetB TetB- F TetB- R CAGTGCTGTTGTTGTCATTAA GCTTGGAATACTGAGTGTAA 570 TetC TetC- F TetC- R CTTGAGAGCCTTCAACCCAG ATGGTCGTCATCTACCTGCC 417 TetD TetD- F TetD- R GCAAACCATTACGGCATTCT TTTTTACCGCGCAGCTTATC 545 TetE TetE- F TetE- R TATTAACGGGCTGGCATTTC AGCTGTCAGGTGGGTCAAAC 543 TetG TetG- F TetG- R GCTCGGTGGTATCTCTGCTC CAAAGCCCCTTGCTTGTTAC 530 Chloramphen icols Cat-1 Cat1- F Cat1- R AACCAGACCGTTCAGCTGGAT CCTGCCACTCATCGCAGTAC 549 Cat-2 Cat2- F Cat2- R AACGGCATGATGAACCTGAA ATCCCAATGGCATCGTAAAG 546 cmlA cmlA- F cmlA- R GGCCTCGCTCTTACGTCATC GCGACACCAATACCCACTAGC 682 cmlB cmlB- F cmlB- R ACTCGGCATGGACATGTACT ACGGACTGCGAATCCATAG 839 Phenicol floR floR- F floR- R ATGACCACCACACGCCCCG AGACGACTGGCGACTTCTCG 1212 Control 16S rRNA 16S rRNA- F 16S rRNA- R GCCTACGGGAGGCAGCAG CCGTCAATTCMTTTGACTTT 907 • Hỗn hợp phản ứng RT - PCR bao gồm các thành phần: - 2µl 10X dream taq buffer (bao gồm 2mM MgCl2) - 2µl dNTPs.
- 1µl mỗi loại primer (10 pmol/µl).
- 0,2µl taq DNA polymerase (5 units/µl) (ABgene). - 1µl template
- Nước cất vừa đủ 20µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 940C/ 3 phút và 25 chu kỳ nhiệt (biến tính 940C/50 giây, ủ bắt cặp mồi 560C/30 giây, kéo dài 720C/45 giây), và kéo dài cuối cùng ở 720C/ 7 phút.
• Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
• Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (1 µl/ml) trong vòng5 phút.
• Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số. Kích thước các băng DNA được so với thang chuẩn (marker).
3.5.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Phân tích hình ảnh kết quả RT-PCR sau khi điện di bằng phần mềm Quantity One (Gel Doc 1000, version 4.6.3, Bio-Rad, Hercules, CA) và tỷ lệ biểu hiện gen kháng kháng sinh/ gen đối chứng xử lý trên Excel
- Vẽ đồ thị bằng phần mềm SigmaPlot v12.0
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY, PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA
Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã tiến hành lấy ngẫu nhiên60 mẫu thịt (30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt gà) vào buổi sáng sớm (7 giờ sáng) tại 3 chợ đầu mối thuộc nội thành Hà Nội để phân lập và xác định đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella spp. có mặt trong các mẫu bị ô nhiễm.
4.1.1. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thịt
lợn, gà
Salmonella là một loại vi khuẩn sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc
và tràn vào thịt khi những con vật này bị mổ. Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng "đột nhập" vào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ.
Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm
vào mùa hè. Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong.Việc phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn
Salmonella trong thức ăn nói chung và các sản phẩm thịt gia súc, gia cầm nói
riêng là việc làm hết sức quan trọng.
Dựa trên tiêu chuẩn của FAO và quyết định số 867/QĐ - BYT của bộ trưởng Bộ Y tế ngày 04/4/1998 thì vi khuẩn Salmonella không được phép có mặt trong 25 gram thực phẩm (thịt tươi, sản phẩm chế biến từ thịt), vì vậy chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra định tính sự có mặt của vi khuẩn này trong các mẫu, chứ không kiểm tra định lượng, từ đó xác định tình trạng ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm có nguồn gốc từ thịt trên địa bàn Hà Nội. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp. từ các mẫu thịt
Loại thịt Số mẫu kiểm
tra Kết quả Số mẫu dương tính Tỷ lệ % Thịt lợn 30 6 20,0 Thịt gà 30 7 23,3 Tổng hợp 60 13 21,67
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: tỷ lệ dương tính với Salmonella khá cao, trong tổng số 60 mẫu được kiểm tra có 13 mẫu thịt đã phân lập được vi khuẩn
Salmonella spp. chiếm tỷ lệ 21,67%. Trong đó, tỷ lệ phân lập Salmonella spp. ở
thịt gà chiếm tỷ lệ 23,3 % cao hơn ở thịt lợn chiếm tỷ lệ 20,0%. Đây là điều đáng lo ngại cho sức khoẻ cộng đồng vì theo TCVN 7046: 2009 quy định, trong thịt và sản phẩm của thịt không được phép có mặt vi khuẩn Salmonella. Như vậy, nếu căn cứ theo các quy định trên và trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này thì có tới 21,67% các mẫu thịt không đạt tiêu chuẩn. Điều này đã giải thích được tại sao vẫn có những vụ ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra trong cả nước trong thời gian qua.
Theo thống kê của Bộ Y tế, chỉ trong 4 tháng đầu năm 2016, cả nước đã xảy ra gần 30 vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, làm trên 1.386 người bị ngộ độc, trong đó có 2 trường hợp tử vong. Riêng trong tháng 4/2016 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 375 người bị ngộ độc. Hầu hết các bệnh nhân bị ngộ độc do ăn phải thức ăn bị nhiễm vi sinh vật bởi thời tiết nóng bức gây ra, cùng với đó là một số trường hợp bị ngộ độc do hấp thụ phải hóa chất tồn dư trong thực phẩm (Minh Thùy, 2016).
Nếu xét riêng tỷ lệ của từng loại thịt thì thấy 20% mẫu thịt lợn và 23,3% mẫu thịt gà đã được xác định là có nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. Nói một cách khác, nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cho người từ thịt gà bị nhiễm Salmonella
spp. cao hơn so với thịt lợn. Kết quả này tương đương với một số nghiên cứu mới được công bố gần đây. Trong một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các loại vi khuẩn khác nhau trong thịt tươi tại các chợ tự do trên địa bàn Hà Nội, Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2006) đã xác định được tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trung bình trong thịt là 30% (trong đó có 47,1% ở thịt gà, 27,3% ở thịt lợn và 19% ở thịt bò).Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Paster thành phố Hồ Chí Minh đã thực tế lấy ngẫu nhiên 1.150 mẫu thực phẩm thịt heo, gà, bò tươi sống tại các chợ trên địa bàn Tp.HCM để xét nghiệm. Kết quả cho thấy, 385 mẫu thịt nhiễm khuẩn
Salmonella. Trong đó, tỷ lệ nhiễm khuẩn Salmonella trong thịt lợn cao nhất
chiếm 39,20% (98/250 mẫu), thịt gà chiếm 35,17% (211/600 mẫu), thịt bò 30,80% (77/250 mẫu). Tính trung bình, tỷ lệ thịt động vật tươi sống bày bán tại