Ngoài các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella như khả năng bám
dính, xâm nhập tế bào, chúng còn sản sinh ra ít nhất ra ba loại độc tố đó là độc tố đường ruột (enterotoxin), nội độc tố (endotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin).
+ Độc tố đường ruột (enterotoxin)
Là loại độc tố thường xuyên được vi khuẩn tiết vào môi trường. Các
Gen quy định khả năng sản sinh enterotoxin nằm trên plasmid, di truyền
bằng tiếp hợp, có thể truyền từ S.typhimurium sang cho E. coli. Enterotoxin tạo
sự rút nước từ cơ thể vào lòng ruột gây tiêu chảy. Độc tố enterotoxin của vi
khuẩn Salmonella có hai thành phần chính là độc tố thẩm xuất nhanh (RPF) và
độc tố thẩm xuất chậm (DPF).
Độc tố thẩm xuất nhanh của Salmonella có cấu trúc và hoạt tính giống
với độc tố chịu nhiệt (ST) của E. coli. Độc tố này có trọng lượng phân tử hơn
90.000, chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ nhưng bị phá huỷ nhanh nếu hấp
dưới áp suất cao và bền vững ở nhiệt độ thấp thậm chí ở nhiệt độ - 200C. Độc
tố chịu nhiệt này thực hiện khả năng thẩm xuất nhanh sau 1 - 2h và có thể kéo dài 48h.
Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc và thành phần giống
độc tố không chịu nhiệt (LT) của E. coli nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt
của Salmonella (Heat - Labiletoxin: LT). Độc tố này bị phá huỷ ở nhiệt độ 700C
sau 30 phút và 560C sau 4 giờ. LT của Salmonella làm thay đổi quá trình rút
nước từ cơ thể vào ruột non, gây nên tiêu chảy. Độc tố LT thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18 - 24h và có thể kéo dài 36 - 48h.
Độc tố đường ruột chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong nuôi cấy kị khí. Độc tố đường ruột tác động vào ruột và hệ thần kinh.
+ Nội độc tố (endotoxin)
Thành phần chủ yếu của endotoxin là lippopolysaccharide (LPS). LPS là
một thành phần cơ bản cấu tạo màng ngoài tế bào vi khuẩn Salmonella, giữ vai
trò là một yếu tố độc lực quan trọng của chúng. Endotoxin được giải phóng từ tế bào vi khuẩn trong quá trình phát triển hoặc do tế bào vi khuẩn bị phân giải.
Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải liên kết với các thụ thể tế bào (các receptor bề mặt tế bào). Trên bề mặt tế bào mẫn cảm LPS như tế bào lympho B, lympho T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan, lách…tồn tại các receptor liên kết với LPS.
Nội độc tố gây độc cao có thể gây chết chuột lang trong vòng 48h với bệnh tích ở ruột non như xung huyết, mảng payer phù nề, có khi hoại tử, gây triệu chứng hôn mê, co giật.
Thành phần của cytotoxin không phải là lippopolysaccharide (Non - LPS)
nằm ở màng ngoài vi khuẩn Salmonella. Đặc tính chung của cytotoxin là khả năng
ức chế tổng hợp protein của tế bào Eukaryotic, đặc tính quan trọng là làm tổn thương tế bào biểu mô. Đa phần độc tính của chúng bị phá huỷ bởi nhiệt.
+ Plasmid - cơ quan di truyền của các yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella.
Plasmid là cơ quan cần thiết di truyền các yếu tố độc lực của rất nhiều chủng Salmonella. Mỗi serotype chứa một số lượng lớn (khoảng từ 50-100) plasmid. Những vi khuẩn có các plasmid di truyền yếu tố độc lực có khả năng trao đổi cho nhau làm cho yếu tố độc lực được nhân rộng nhanh trong quần thể vi khuẩn. 2.3.5. Ý nghĩa của việc xác định sự có mặt của Salmonella trong thịt
Salmonella là vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhất trong các vi khuẩn cần kiểm tra trong thực phẩm mà đặc biệt là thực phẩm tươi sống và thực phẩm đông
lạnh. Vi khuẩn Salmonella nhiễm trên bề mặt thịt rồi sinh sôi phát triển dần thấm
sâu vào bên trong làm hư hỏng thịt. Quá trình ngấm sâu này phụ thuộc vào điều
kiện bên ngoài. Ở điều kiện bình thường sau 24 giờ Salmonella có thể ngấm sâu
trong 14 cm vào bên trong thịt. Điều này nói lên mức độ nguy hiểm khi có mặt Salmonella trong thịt.
2.4. HIỆN TƯỢNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SALMONELLA
2.4.1. Tính kháng thuốc của vi khuẩn 2.4.1.1. Lịch sử 2.4.1.1. Lịch sử
Ngày 3/9/1928, Alexander Fleming là thầy thuốc xứ Scotland phát hiện ra kháng sinh Penicillin từ nấm Penicillinum notatum. Năm 1941, kháng sinh này xuất hiện trên thị trường Mỹ nhưng chỉ ít lâu sau y giới đã quan sát thấy các ca đầu tiên vi khuẩn kháng lại kháng sinh.
Năm 1943, nhà khoa học Mỹ gốc Nga S.Waksman tìm ra Streptomycin, một loại kháng sinh mới. Đáng buồn là đến năm 1944 chính Fleming lên tiếng cảnh báo về hiện tượng kháng thuốc kháng sinh. Năm 1947, ở Pháp đã có mạng lưới chính thức giám sát thuốc kháng sinh bị kháng.
Ngày 12/6/2000, một báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ước tình: Trong vòng 20 năm, bệnh lao có thể trở thành bệnh nan y do thuốc kháng sinh không còn hiệu lực. Cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân hiện nay không còn ai giữ được niềm phấn khởi như Bộ trưởng Bộ Y tế Mỹ tuyên bố năm 1969 là nhân loại đã
gần đi tới việc “đóng lại cuốn sách về các bệnh nhiễm khuẩn”. Đã 20 năm nay, các hiệp hội thầy thuốc tổ chức mạng lưới phát hiện vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, hầu hết các nước châu Âu có mạng lưới này ở cấp quốc gia.
Như vậy, vi khuẩn kháng thuốc đã được quan tâm từ rất sớm.
2.4.1.2. Khái niệm
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976), một cá thể hoặc một loài vi khuẩn thuộc một loài nhất định được gọi là kháng thuốc nếu có thể sống và sinh sản trong môi trường có nồng độ kháng sinh cao hơn nồng độ ức chế sự sinh sản của phần lớn những cá thể khác trong cùng một canh khuẩn hoặc những nòi khác cùng loài.
2.4.1.3. Phân loại
Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành 2 loại.
- Kháng thuốc tự nhiên: Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, hoặc có thể loại vi khuẩn đó không có vị trí công kích, điểm tác dụng của kháng sinh.
- Kháng thuốc thu được: Là hiện tượng kháng thuốc phát sinh do sự tiếp xúc nhiều lần với chất kháng sinh hoặc lây truyền từ vi khuẩn đề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm. Bao gồm: đột biến kháng và kháng thuốc lây lan.
2.4.2. Cơ chế gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn
Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn có được do các biến đổi ở hệ gen của chúng, đó là sự gia tăng tần số gen kháng thuốc gây ra, do chọn lọc rồi truyền theo chiều dọc (vertical transfer) từ bố mẹ truyền cho con cái. Trong thực tế sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu lại do khả năng truyền các gen kháng thuốc theo chiều ngang (horizontal transfer) giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng 1 thế hệ, hoặc giữa các loài vi khuẩn của các họ khác nhau.
Giữa các vi khuẩn khác nhau, gen kháng thuốc có thể được trao đổi qua 3 cách:
- Tải nạp (transduction): là quá trình DNA được thực khuẩn thể (phage) sát nhập và chuyển cho một vi khuẩn khác.
- Biến đổi hay còn gọi là chuyển dạng (transformation): là quá trình một đoạn DNA trần (có nguồn gốc từ 1 tế bào vi khuẩn chết) đi vào một tế bào vi khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm sắc thể (crossover).
- Tiếp hợp (conjugation): là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng hợp yếu tố giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient). Từ cầu nối này, một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được chuyển cho vi khuẩn nhận. Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage trên bề mặt của chúng. Trong tiến trình biến đổi, DNA phải chèn vào bộ gen nhờ tương đồng về di truyền. Như vậy, với cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra. Dạng trao đổi này chỉ có thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền.
2.4.3. Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella
Kháng kháng sinh là hiện tượng tự nhiên, nhưng yếu tố xã hội cũng tham gia vào vấn đề này. Những yếu tố gia tăng sự kháng thuốc của vi khuẩn là do việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong điều trị nhân y cũng như thú y và sự bổ
sung kháng sinh vào thức ăn chăn nuôi (Wise et al., 1999). Trong năm 2001
người ta đã thống kê 26,6 triệu tấn kháng sinh dùng cho động vật của nước Anh thì có 2 triệu tấn dùng trong điều trị, lượng còn lại được dùng bổ sung vào thức ăn như chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh (Brody, 2001). Vi khuẩn kháng thuốc phát triển trong thực phẩm là một trong những nguyên nhân gây nên hiện tượng khó điều trị bệnh cho người. Năm 1983 tại miền tây nước Mỹ đã xảy ra vụ
ngộ độc thực phẩm, 18 bệnh nhân phải nhập viện do ăn thịt bò nhiễm Salmonella
có khả năng kháng lại tất cả các loại thuốc kháng sinh đang được sử dụng để điều trị tại bệnh viện và một số bệnh nhân đã bị chết. Với cơ chế lan truyền gien đề kháng kháng sinh và việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng như trong điều trị cho động vật hiện nay dẫn đến hậu quả khó lường trước được.
Tại Brazil, trong số 91 chủng S.enteritidis phân lập từ thịt gà, thực phẩm của
người, và các mẫu liên quan đến gia cầm (nền chuồng, phân), 90,1% số chủng kháng với hơn một loại kháng sinh, 75,8% số chủng kháng Sulfonamides, Nitrofuran là 52,8%, 51,6% số chủng cùng kháng với nhiều loại kháng sinh (Dias
de Oliveiria et al., 2005; Nguyễn Thị Ngà, 2011).
Ở cộng hoà liên bang Đức, người ta phát hiện rất nhiều chủng Salmonella mang các gen kháng lại kháng sinh tồn tại ở người và động vật, do có sự đột biến diễn ra trên đoạn gen Gyr A và Gyr B trong cấu trúc của phân tử AND tạo nên sự kháng lại kháng sinh Quinolone. Nhiều chủng vi khuẩn
liên bang Đức mang các plasmid kháng kháng sinh (Erhard Tietze et al., 1983 ; trích Nguyễn Thị Ngà, 2011).
Những nghiên cứu về tính kháng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh
trong thú y cho thấy trong 88 chủng Salmonella kháng Ampicillin,
Chloramphenicol, Penicillin, Chlotracycline, Neomycin, Furazolidon,
Streptomycin và Sulphonamid, chưa có chủng Salmonella nào kháng lại
Furazolidon. Chỉ có một chủng Salmonella duy nhất kháng lại với Neomycin
(Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho, 1998). Theo Đinh Bích Thuý và cs., (1995),
có 37,4% - 68,1% số chủng Salmonella sp kháng lại Chloramphenicol; 74,6% -
89,24% kháng lại Streptomycin; 4,26% kháng lại Gentamycin.
Nguyễn Viết Không và cs. (2012), khi nghiên cứu về tình trạng ô nhiễm Salmonella tại các điểm giết mổ gia cầm quy mô nhỏ tại các huyện ngoại thành Hà
Nội cho biết các chủng Salmonella có khả năng kháng đối với những kháng sinh
thông thường với tần số khác nhau Streptomycin (84,44%), Tetracycline (82,22%), Ciprofloxacin (35,56%), Norfloxacin (35,56%), Ampicillin (62,22%), Nalidixic axit (62,22%), Trimethoprim (80,00%), Ceftazidime (33,33%), Gentamycin (33,33%), Nitrofurantoin (33,33%).
Kết quả nghiên cứu của Trương Hà Thái và cs. (2012), cho thấy tỷ lệ kháng
kháng sinh của Salmonella là Tetracycline (58,5%), Sulphonamides (58,1),
Streptomycine (47,3%), Ampicillin (39,8%), Chloramphenicol (37,3%), Trimethoprim (34%), Nalidixic acid (27,8%).
Tại Thái Lan, Pulsrikarn và cs. (2012), nghiên cứu serotype và tính kháng
sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ lợn và thịt lợn cho thấy 69% số chủng
kháng lại Tetracycline, 50% số chủng kháng Ampicillin, 36% số chủng kháng Sulfamethoxazole-trimethoprim, 31% kháng Streptomycin. Không có chủng nào kháng lại Amoxicillinclavulanic acid, Norfloxacin.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn.
- Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I. 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 3 năm 2017. 3.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Các hộ chăn nuôi lợn tại Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn.
Mẫu thịt lợn được lấy vào 6 - 7 giờ sáng tại một số chợ thuộc Thành phố Lạng Sơn.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.3.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn Salmonella
Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW).
Môi trường canh Rappaport – Vassiliadis Soya Pepton (RV). Môi trường Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn). Môi trường brain heart broth (BHB).
Môi trường Xyloze – Lyzine – Tergitol 4 (XLT4).
Môi trường Brilliant Green Agar (BGA). Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI). Thuốc thử Kovac’s/Indol.
Catalase. Oxidase.
Kít nhuộm gram (Merck).
Môi trường kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella:
Glucose; Manitol; Lactose; Sorbitol;
Dextrose; Sucrose; Galactose; Arabinose.
3.3.2.2. Môi trường, hóa chất dùng làm kháng sinh đồ
Khoanh giấy tẩm kháng sinh: + Kanamycin (30μg); + Amoxicillin/clavulanic (20/10μg); + Erythromycin (15μg); + Doxycycline (30μg); + Tetracycline (30μg); + Norfloxacin (10μg); + Colistin (10μg); + Lincomycin (10μg);
+ Floxy (flofenicol và doxycycline) (30μg); + Enrofloxacin (50μg);
+ Tylosin (50μg); + Ttiamulin (100μg); + Ceftiofur (25µg); + Streptomycin 10µg.
Thạch Mueller - Hinton agar. Nước muối sinh lý 0,85%. 3.3.3. Trang thiết bị, dụng cụ Trang thiết bị: + Nồi hấp; + Tủ ấm; + Tủ sấy; + Máy Stomacher; + Máy li tâm; + Buồng cấy;
+ Máy đo pH; + Máy đếm khuẩn lạc; + Máy trộn Vortex … Dụng cụ: + Bình tam giác; + Ống nghiệm; + Đĩa petri; + Cốc đong; + Ống đong; + Phễu; + Pipette; + Đèn cồn; + Que cấy; + Túi đựng mẫu;
+ Thước đo vòng vô khuẩn…;
+ Tất cả các dụng cụ, hóa chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Điều tra tình trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn
3.4.2. Phân lập xác định tình trạng ô nhiễm và kiểm tra độc lực của vi khuẩn
Salmonella trên thịt lợn tại một số chợ trên địa bàn Thành phố
3.4.3. Xác định tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được trên các mẫu thịt lợn
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp điều tra 3.5.1. Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh tại các trang trại chăn nuôi, hộ chăn nuôi lợn bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp chủ chăn nuôi. 3.5.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn. Lấy mẫu theo TCVN:
Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: TCVN 4833 - 1:2002; TCVN 4833 - 2:2002.
Mẫu sau khi lấy phải đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO
6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và
đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37o trong 18 – 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1ml sang ống chứa 10ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến
42oC. sau đó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 10ml Muller
Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi
trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu đỏ hồng, tròn bóng,
lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37oC/24
giờ. Đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch. Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng
của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường
này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ