Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Điều tra tình trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn
3.4.2. Phân lập xác định tình trạng ô nhiễm và kiểm tra độc lực của vi khuẩn
Salmonella trên thịt lợn tại một số chợ trên địa bàn Thành phố
3.4.3. Xác định tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được trên các mẫu thịt lợn
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp điều tra 3.5.1. Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh tại các trang trại chăn nuôi, hộ chăn nuôi lợn bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp chủ chăn nuôi. 3.5.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn. Lấy mẫu theo TCVN:
Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: TCVN 4833 - 1:2002; TCVN 4833 - 2:2002.
Mẫu sau khi lấy phải đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO
6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và
đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37o trong 18 – 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1ml sang ống chứa 10ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến
42oC. sau đó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 10ml Muller
Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi
trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. Đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu đỏ hồng, tròn bóng,
lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37oC/24
giờ. Đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch. Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng
của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường
này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường
Tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24h. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s. Nếu
xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng – phản ứng âm tính.
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm dung dịch Oxidase (Remel). Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu tím đen hay giấy không đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già
(H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu
không thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase dương tính.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra độc lực các chủng Salmonella phân lập được Kiểm tra độc lực của vi khuẩn theo phương pháp thường quy của Viện Thú Kiểm tra độc lực của vi khuẩn theo phương pháp thường quy của Viện Thú y Quốc gia:
Chọn chuột nhắt trắng có trọng lượng từ 18 - 20g, khoẻ mạnh.
Tiêm 0,2 ml canh trùng nguyên của chủng vi khuẩn cần kiểm tra đã nuôi
cấy ở môi trường BHI ở nhiệt độ 37oC trong 24h vào xoang phúc mạc.
Theo dõi thời gian gây chết chuột và số chuột chết.
Theo dõi triệu chứng, bệnh tích và phân lập vi khuẩn từ chuột chết (Phạm Hồng Ngân, 2010).
3.5.5. Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng
Salmonella phân lập được
Phương pháp Bauer - Kirby dùng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn mô tả bởi Carter và Cole năm 1990 được sử dụng trong thí nghiệm này.
Môi trường tiêu chuẩn dùng để thử kháng sinh đồ theo phương pháp Bauer - Kirby là môi trường Muller - Hinton agar được chuẩn bị theo hướng dẫn của nơi sản xuất và được đổ vào đĩa petri đảm bảo mặt thạch dày 4 mm.
Đĩa thạch có đường kính 10 cm cần đổ 25 ml môi trường, đĩa có đường kính 15 cm đổ 60 ml môi trường.
Các đĩa thạch được bao gói bảo quản ở nhiệt độ 4 - 80C, không quá 2 tuần,
trước khi sử dụng để tủ ấm 10 - 20 phút.
Vi khuẩn cần kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh nuôi cấy trên môi trường lỏng Brain heart infusion (BHI).
Dùng micropipet vô trùng chuyển 10 µl canh trùng lên mặt đĩa thạch, dàn đều, để yên trong thời gian 3 - 5 phút cho khô mặt thạch.
Dùng panh đặt và cố định các đĩa giấy chứa kháng sinh cần kiểm tra sao cho các đĩa giấy này tiếp xúc với mặt thạch và cách nhau không dưới 15mm, để
yên 15 - 20 phút rồi lật úp đĩa thạch, ủ ấm hiếu khí ở nhiệt độ 37°C.
Đọc kết quả sau 18 – 24 h bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn.
Kết quả này được so sánh với bảng tiêu chuẩn cho từng loại kháng sinh để đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó.
Bảng 3.5. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn
STT Tên kháng sinh Ký hiệu
mã hóa Lượng kháng sinh(Mg) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) R(<) I H(>) 1 Ampicillin AL 20 11 14-17 15 2 Ceftiofur CF 30 17 18-20 21 3 Enrofloxaxin ENR 20 16 17-19 20 4 Norfloxacin NOR 10 12 13-16 17 5 Doxycycline DO 30 9 10-12 13 6 Tetracyclin TE 30 14 15-18 19 7 Streptomycin ST 100 14 15-17 18 8 Colistin sulphate CL 10 8 9-10 11 9 Erythromycin E 15 19 20-30 29 10 Floxy FL 30 14 15-18 19
Ghi chú: H (high): mẫn cảm cao
I (Intermediate): mẫn cảm trung bình
R ( Resistant): Kháng
3.5.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi chép và lưu trong file excel. Các tỉ lệ, số trung bình và độ lệnh chuẩn được tính toán trong phần mềm Excel, Microsoft Windows, phiên bản 7.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TRÌNH TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH TRONG CHĂN NUÔI LỢN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ LẠNG SƠN TRONG CHĂN NUÔI LỢN TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ LẠNG SƠN
Để đánh giá tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi lợn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn, chúng tôi tiến hành một nghiên cứu cắt ngang bằng cách phỏng vấn trực tiếp 63 cơ sở chăn nuôi lợn với các hình thức chăn nuôi như: chăn nuôi nông hộ, gia trại và trang trại thuộc 8 xã, phường được chọn ngẫu nhiên trên địa bàn. Kết qua thu được trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh tại các cơ sở chăn nuôi thuộc Thành phố Lạng Sơn (n = 63)
Stt Địa phương
Số điều tra ( Nông hộ, gia trại và trang trại)
Số sử dụng ( Nông hộ, gia trại
và trang trại)
Tỷ lệ (%)
1 Phường Hoàng Văn Thụ 5 5 100,00
2 Phường Đông Kinh 3 3 100,00
3 Phường Chi Lăng 6 6 100,00
4 Phường Vĩnh Trại 8 8 100,00
5 Phường Tam Thanh 4 4 100,00
6 Xã Quảng Lạc 12 12 100,00
7 Xã Mai Pha 15 15 100,00
8 Xã Hoàng Đồng 10 10 100,00
Tổng 63 63 100,00
Kết quả Bảng 4.1. cho thấy: trong tổng số 63 nông hộ, gia trại và trang trại chăn nuôi lợn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn thì toàn 63 nông hộ, gia trại và trang trại đều sử dụng kháng sinh chiếm tỷ lệ 100% với mục đích phòng, trị bệnh và kích thích tăng trưởng.
Nguồn cung cấp các loại kháng sinh cho người chăn nuôi chủ yếu là từ các đại lý thuốc thú y tại địa phương hoặc từ bác sỹ thú y, thú y viên hoặc các công ty thuốc về tư vấn và hướng dẫn, khuyến khích bà con nông dân sử dụng sản phẩm của đơn vị.
Kết quả điều tra từ các chủ hộ cho thấy: phần lớn họ biết hoặc nghe thấy khái niệm “nhờn thuốc” trong chăn nuôi. Nhưng, theo các chủ hộ trong quá trình điều trị con vật bị bệnh, nếu dùng thuốc này không khỏi thì họ tự động thay đổi
thuốc theo kinh nghiệm cá nhân hoặc theo tư vấn từ các bác sĩ thú y, thú y viên hoặc theo các công ty về thuốc tư vấn mà không hiểu về cơ chế và tác hại của nó. Đây là một nguyên nhân quan trọng dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh ngày càng lan rộng.
Mặt khác, kết quả điều tra cũng cho thấy: tại các hộ chăn nuôi lợn nhỏ lẻ tại địa phương thì khi con vật bị bệnh thường tự ý dùng kháng sinh để điều trị chứ không lấy mẫu gửi về các phòng thí nghiệm để xét nghiệm và tìm ra kháng sinh còn mẫn cảm với mầm bệnh để có phác đồ điều trị hiệu quả. Chỉ có một số trang trại vừa và nhỏ, do có sự hỗ trợ của các công ty thuốc hoặc cám nên khi con vật bị bệnh họ có lấy mẫu gửi đi xét nghiệm nhưng thời gian chờ đợi lâu nên họ sử dụng các loại kháng sinh hiện có để điều trị tạm thời.
Kết quả điều tra tình hình sử dụng các loại kháng sinh trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn được chúng tôi tổng hợp và trình bày ở Bảng 4.2 và hình 4.1.
Kết quả Bảng 4.2. chúng tôi nhận thấy: trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn các loại kháng sinh được sử dụng nhiều nhất gồm: Floxy, chiếm 7,74%; Ampicolis, chiếm 7,45%; Streptomycin, chiếm 7,17%; Enrofloxacin, chiếm 7,03%; Macavet, chiếm 6,89%; Ciprofloxacin, chiếm 6,75% và Ampicillin, chiếm 6,47%.
Mặt khác, một số kháng sinh được lưu hành thường xuyên trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn nhưng tần suất sử dụng lại tương đối thấp như: Amoxicicllin/Clavulanic acid, chiếm 1,55%; Hanoxylin LA, chiếm 1,27%; Tiamulin, chiếm 1,13%; Hanflor, chiếm 0,84%; Gentamycin, chiếm 0,7% và Hagentylo, chiếm 0,42%.
Như vậy, với việc sử dụng kháng sinh tràn lan như hiện nay cùng với sự quản lý thiếu chặt chẽ của các cơ quan quản lý nhà nước chính là nguyên nhân dẫn đến các dòng vi khuẩn kháng thuốc. Theo báo cáo của một số nước, 50% lượng kháng sinh của họ được sử dụng trong nông nghiệp, phần lớn là dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Trong năm 2001 người ta đã thống kê 26,6 triệu tấn kháng sinh dùng cho động vật của nước Anh thì có 2 triệu tấn dùng trong điều trị, lượng còn lại được dùng bổ sung vào thức ăn như chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh (Brody, 2001).
Bảng 4.2. Tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi lợn tại Thành phố Lạng Sơn Stt Tên kháng sinh Kết quả Số sử dụng (Hộ/Gia/Trang trại) Tỷ lệ (%) 1 Ampicillin 46 6,47 2 Ampicolis 53 7,45 3 Ampikana 23 3,23 4 Ciprofloxacin 48 6,75 5 Colistin 31 4,36 6 Doxycycline 15 2,11 7 Enrofloxacin 50 7,03 8 Floxy 55 7,74 9 Genta – Costrim 27 3,80 10 Gentamycin 5 0,70 11 Hagentylo 3 0,42 12 Hanflor 6 0,84 13 Hanoxylin LA 9 1,27 14 Kanamycin 25 3,52 15 Macavet 49 6,89 16 Neomycin 18 2,53 17 Norfloxacin 33 4,64 18 Penicillin 21 2,95 29 Spectinomycin 24 3,38 20 Streptomycin 51 7,17 21 Sulfamethaxazol/trimethoprime 30 4,22 22 Tetracycline 36 5,06 23 Tiamulin 8 1,13 24 Tylosin 15 2,11 25 Tylosin-genta 19 2,67
Hình 4.1a. Một số loại kháng sinh được sử dụng trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn
Hình 4.1b. Một số loại kháng sinh được sử dụng trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây trên địa bàn Thành phố Hà Nội khi cho rằng: các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện: Ampicillin, Gentamycin, Colistin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Norfloxacin, Kanamycin, Penicillin, Ceftazidime, Nalidixic acid, Tetracycline, Streptomycin, Trimethoprim (Cam Thị Thu Hà, 2013).
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM VÀ KIỂM TRA ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP. TRÊN THỊT LỢN TRA ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA SPP. TRÊN THỊT LỢN TẠI MỘT SỐ CHỢ THUỘC ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ LẠNG SƠN
4.2.1. Trực trạng giết mổ và vận chuyển thịt đến bán tại một số chợ thuộc địa bàn thành phố Lạng Sơn
Mẫu thịt được lấy tại các quầy bán thịt trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn vào buổi sáng sớm. Tại mỗi chợ, chúng tôi lấy xác xuất ngẫu nhiên 20 quầy, mỗi quầy lấy ngẫu nhiên 04 vị trí sao cho tổng trọng lượng mẫu khoảng từ 20 - 30g, cho vào túi đựng mẫu vô trùng hoặc đựng trong túi dùng để pha loãng và đồng
nhất mẫu, gửi về phòng xét nghiệm. Kết quả thu thập mẫu được tổng hợp và trình bày ở Bảng 4.3, Hình 4.1 và hình 4.2, hình 4.3.
Kết quả bảng 4.3 cho thấy: trong tổng số 160 mẫu thu thập được tại các chợ thuộc địa bàn Thành phố Lạng Sơn, có 126 mẫu thu thập được bày bán bằng phương thức tự giết mổ, chiếm 78,75% (126/160). Trong khi đó, số mẫu thu thập được bày bán với phương thức giết mổ tại lò mổ chỉ chiếm khoảng 21,25% (34/160). Đây là mối nguy dẫn đến tình trạng mất vệ sinh an toàn thực phẩm trong quá trình giết mổ do điều kiện giết mổ tại các hộ gia đình không đảm bảo như: phương tiện, nguồn nước giết mổ không đảm bảo, không được kiểm soát từ các cơ quan quản lý nhà nước.
Tại xã Mai Pha và Hoàng Đồng là hai chợ có tỷ lệ thịt được bày bán tại chợ được giết mổ từ các hộ gia đình (tự giết mổ) chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm 100% (20/20). Tiếp đến là Quảng Lạc, có 95,00% thịt lợn được bày bán tại chợ là do tự giết mổ. Kế đến là chợ Hoàng Văn Thụ, có 85,00% là do tự giết mổ rồi bán tại chợ. Tỷ lệ thịt lợn bán tại chợ do tự giết mổ tại phường Vĩnh Trại cũng chiếm tỷ lệ tương đối cao, khảng 75,00% (15/20). Chợ có tỷ lệ thịt lợn bày bán tại chợ do các tiểu thương tự giết mổ chiếm tỷ lệ thấp nhất là phường Chi Lăng, chiếm 50,00% (10/20).
Bảng 4.3. Kết quả thu thập mẫu thịt lợn tại các chợ trên địa bàn Thành phố Lạng Sơn (n = 160)
Địa điểm mẫu
Số lượng
mẫu
Phương thức giết mổ Phương thức vận chuyển
Tự mổ Tỷ lệ (%) Lấy từ lò mổ Tỷ lệ (%) Xe máy Tỷ lệ (%) Ô tô Tỷ lệ (%) Hoàng Văn Thụ 20 17 85,00 3 15,00 18 90,00 2 10,00 Đông Kinh 20 13 65,00 7 35,00 14 70,00 6 30,00 Chi Lăng 20 10 50,00 10 50,00 17 85,00 3 15,00 Vĩnh Trại 20 15 75,00 5 25,00 16 80,00 4 20,00 Tam Thanh 20 12 60,00 8 40,00 11 55,00 9 45,00 Quảng Lạc 20 19 95,00 1 5,00 18 90,00 2 10,00 Mai Pha 20 20 100,0 0 0,00 20 100,0 0 0,00 Hoàng Đồng 20 20 100,0 0 0,00 20 100,0 0 0,00 Tổng 160 126 78,75 34 21,25 134 83,75 26 16,25
Hình 4.2a. Tỷ lệ phương thức giết mổ và phương thức vận chuyển thịt tại một số chợ thuộc Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn
Hình 4.2b. Tỷ lệ phương thức giết mổ và phương thức vận chuyển thịt tại một số chợ thuộc Thành phố Lạng Sơn, tỉnh Lạng Sơn
Kết quả. Bảng 4.3 cho thấy: mặc dù, tỷ lệ người dân tự giết mổ đem bán rất cao; nhưng phương thức vận chuyển từ nơi giết mổ đến nơi bán cũng không đảm bảo an toàn vệ sinh. Trong tổng số 160 mẫu được thu thập, có 134 mẫu thịt được vận chuyển bằng phương tiện xe máy, chiếm 83,75% (134/160). Trong khi đó số