3.2.1.Địa điểm nghiên cứu
- Điều tra thành phần bệnh, diễn biến bệnh loét thanh long tại một số vùng trồng thanh long ở tỉnh Quảng Ninh như Đông Triều, Uông Bí và Quảng Yên.
- Các thí nghiệm trong phòng và lây bệnh nhận tạo được tiến hanh tại phòng thí nghiệm và nhà lưới của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Thí nghiệm phòng trừ bệnh hại thanh long trên đồng ruộng/vườn thanh long được bố trí và thực hiện tại phường Cộng Hòa, thị xã Quảng Yên, Quảng Ninh
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Toàn bộ nội dung thí nghiệm và báo cáo được tiến hành từ tháng 1/2015 đến tháng 4/ 2016.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra thành phần bệnh hại thanh long tại Quảng Ninh (vì chưa có ghi nhận về thành phần bệnh hại thanh long tại Quảng Ninh nên chúng tôi đã tiến hành điều tra thành phần bệnh chính tại một số vùng trồng thanh long chính của Quảng Ninh như Quảng Yên, Uông Bí và Đông Triều).
- Điều tra mức độ, diễn biến bệnh loét (theo tài liệu nước ngoài) hay còn gọi là đốm nâu (theo các tài liệu của Việt Nam) tại Quảng Ninh (Đông Triều, Uông Bí, Quảng Yên).
- Xác định nấm gây bệnh loét thanh long tại Quảng Ninh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng rDNA-ITS của nấm.
- Xác định đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của nấm gây bệnh loét thanh long tại Quảng Ninh.
- Thử nghiệm biện pháp phòng trừ bệnh loét trên thanh long tại phường Cộng Hòa, thị xã Quảng Yên, Quảng Ninh.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp điều tra ngoài đồng ruộng
* Điều tra thành phần bệnh
Chúng tôi tiến hành quan sát sự xuất hiện của các bệnh nấm, vi khuẩn và virus gây hại trên thanh long và đánh giá tỷ lệ bệnh như sau:
* Điều tra diễn biến bệnh loét thanh long
+ Chọn địa điểm điều tra
Cây thanh long được trồng phổ biến ở Quảng Ninh từ năm 2005 đến nay. Tuy nhiên, thanh long được trồng tập trung chủ yếu ở Đông Triều, Uông Bí, Quảng Yên, Hoành Bồ, Ba Chẽ và Móng Cái. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tập trung điều tra diễn biến bệnh loét thanh long tại 3 đơn vị cấp huyện Đông Triều, Uông Bí và Quảng Yên.
+ Phương pháp điều tra
Do chưa có qui chuẩn cho điều tra diễn biến bệnh hại thanh long nói chung và bệnh loét thanh long nói riêng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng điều tra diễn biến bệnh loét thanh long theo QCVN 01-38: 2010 của Bộ nông nghiệp và PTNT
- Điều tra 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 30 cây - Tính tỷ lệ bệnh ở các vườn thanh long điều tra
Tổng số thân/cành bị bệnh
- TLB (%) = --- x 100 Tổng số thân/cành điều tra [(N1 x 1) + ... + (Nn x n)] - CSB (%) = --- x 100 N x 9 Trong đó: N1: là số cành/thân bị bệnh ở cấp 1; Nn: là số cành/thân bị bệnh ở cấp n; N: là tổng số cành/thân điều tra;
9: là cấp bệnh cao nhất của thang phân cấp Thang phân cấp bệnh: Cấp 0: Không có vết bệnh Cấp 1: Vết bệnh <20% diện tích thân/cành Cấp 3: Vết bệnh 20-30% diện tích thân/cành Cấp 5: Vết bệnh 31-45% diện tích thân/cành Cấp 7: Vết bệnh 46-65% diện tích thân/cành Cấp 9: Vết bệnh >65% diện tích thân/cành
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.4.2.1. Phân lập nấm gây bệnh
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Đĩa Petri, ống đong, ống nghiệm, bình tam giác, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 140oC trong 2 giờ.
*) Môi trường WA (Water Agar) Thành phần:
- Nước cất : 1000ml - Agar : 20g Cách điều chế:
Đun sôi nước cất, sau đó cho agar vào khuấy đều cho tan hết rồi đổ vào trong bình tam giác sạch, bịt kín miệng bằng giấy bạc. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 1.5 atm trong thời gian 20 – 25 phút, để nguội 55 – 60oC, sau đó rót vào đĩa petri đã được khử trùng ở 140oC trong 2 giờ.
*) Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Thành phần: - Nước cất : 1000ml - Khoai tây : 200g - Đường D-glucose : 20g - Agar : 20g Cách điều chế:
Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ, thái hạt lựu cho vào nồi nước cất chứa 250ml đun sôi, sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc, cho thêm nước cất đủ 250ml. Sau đó, cho từ từ agar vào khuấy đều rồi cho đường Dextro vào. Môi trường được cho vào bình tam giác đậy nút giấy bạc lại. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 1.5atm trong thời gian 20 – 25 phút, để nguội 55 – 60oC, rồi rót vào đĩa petri đã được khử trùng ở 140oC trong 2 giờ.
*) Môi trường CLA (Carnation leaf Agar)
- Điều chế giống môi trường WA, sau đó bổ sung thêm các mẩu lá cẩm chướng đã được hấp khử trùng.
*) Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)+dịch chiết thân thanh long - Điều chế giống môi trường PGA. Tuy nhiên, bổ sung thêm 200gram thân thanh long cắt nhỏ và đun cùng khoai tây.
Phân lập nấm gây bệnh
- Chọn những mẫu bệnh mới, điển hình. Mẫu bệnh được rửa sạch bằng xà phòng 2- 3 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi thấm khô vết bệnh bằng giấy thấm đã vô trùng. Dùng dao mổ cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 1- 2mm và đặt lên môi trường WA. Sau khi nấm mọc, tiến hành cắt đỉnh sinh trưởng của sợi nấm cấy truyền sang các đĩa PGA mới để thu được nguồn nấm thuần sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Phân lập đơn bào tử: Trên bề mặt vết bệnh loét thanh long, có các chấm đen nhỏ li ti, các chấm đen này được xác định là quả cành của nấm gây bệnh. Khi phá vỡ quả cành, các bào tử phân sinh được giải phóng. Chúng tôi đã sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát các bào tử phân sinh, sau đó sử dụng kim thủy tinh lấy chính xác 1 bào tử của nấm gây bệnh cấy sang môi trường WA, khi sợi nấm mọc ra, dùng que cấy cắt 1 miếng thạch có chứa đỉnh sinh trưởng của nấm rồi sau đó cấy chuyển sang môi trường PGA và làm các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh loét thanh long
Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PGA và giữ ở nhiệt độ 25-28oC để quan sát các đặc điểm hình thái cũng như sự phát triển của nấm, màu sắc tản nấm, hình thái của bào tử,… sau các ngày nuôi cấy.
* Xác định nấm gây bệnh loét thanh long tại Quảng Ninh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng rDNA-ITS
Nguồn nấm thuần được nuôi cấy trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 25 – 28oC trong 7 ngày. DNA của nấm được chiết theo 2 phương pháp:
*) Phương pháp đun sôi
+ Cho 0.1ml nước cất vào tube 0.5ml + Cạo sợi nấm cho vào tube chứa nước cất
+ Cho tube vào bìa xốp rồi đem đun sôi trong 30 phút + Sau đó đem để tủ -80oC để làm khuôn cho phản ứng PCR
*) Phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987) Thành phần đệm chiết CTAB (100ml): NaCl 2M : 11.68g EDTA 25mM : 5ml Tris HCl 100mM (pH8) : 10ml CTAB 2% : 2g PVO 2% : 2g
Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB: + Ủ đệm CTAB ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút
+ Cạo sợi nấm đã được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PGA cho vào ống 1.5ml, sau đó thêm 200µl đệm CTAB vào rồi nghiền nhuyễn, sau cùng cho thêm 500µl CTAB.
+ Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút sau đó để nguội, ly tâm ở 13000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút 700µl dịch trên tủa ra ống 1,5 ml mới, bổ sung thể tích tương đương của Chlorofom isoamyl (24:1) vào ống 1.5ml và lắc đều, ly tâm ở 13000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút 400µl dịch trên tủa ra ống 1.5 ml mới, bổ sung thể tích tương đương isopeopanol, để lạnh ở -20oC ít nhất trong 30 phút hoặc qua đêm.
+ Ly tâm ở 13000 rpm trong 15 phút ở nhiệt độ phong + Loại bỏ phần dung dịch phía trên và thu lấy cặn (kết tủa) + Rửa phần kết tủa với cồn 70% 2 lần, loại bỏ hết cồn
+ Để khô trong không khí hoặc buồng cấy vi sinh vật trong 30 phút
+ Bổ sung 30 - 50µl đệm TE, hòa tan phần kết tủa và giữ ở nhiệt độ -20oC làm khuôn cho phản ứng PCR.
Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1999).
ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GAAAGTAAAGTCGTAACAAGG-3’
Điều kiện phản ứng PCR:
Phản ứng PCR được thực hiện trong ống 0.5ml với tổng thể tích phản ứng 20µl, thành phần của phản ứng PCR: Thành phần Thể tích (µl) H2O 8.5 GoTag Mix (2x) 10 ITS4 0.5 ITS5 0.5 DNA 0.5 Tổng thể tích 20 Thực hiện phản ứng PCR:
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Khởi đầu biến tính 94 4 phút 1
Các chu kỳ tổng hợp 94 30 giây 35 52 35 giây 72 1 phút Kết thúc 72 5 phút 1 Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị đệm điện di
1. Pha đệm điện di TAE 0.5x từ dung dịch gốc TAE 50x: Lấy 100ml TAE 50X cho vào cốc 1000ml nước cất, lắc đều
2. Chuẩn bị bản gel: cân 1g agarose chi vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE 0.5x, sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose, sau khi agarose đã tan hoàn toàn đung trong lò vi sóng 2 – 3 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 5µl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng
3. Lấy các ống 0.5ml đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự. Cho vào mỗi tube 4µl Loading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5 giây.
Tiến hành:
1. Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng).
2. Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm).
3. Nhỏ mẫu vào giếng. Ngoài các mẫu PCR, cần nhỏ thêm 1 giếng Marker DNA làm chuẩn.
4. Cắm nguồn điện cho máy điện di, đạt hiệu điện thế 100V trong 20 phút. 5. Sau khoảng 25phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy soi gel (phát tia UV), quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
Tinh sạch DNA dùng Kit tinh sạch thương mại
DNA được tinh sạch dùng Kit chiết thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA thu được sử dụng cho phản ứng giải trình tự gene.
Giải trình tự sản phẩm PCR
Sử dụng DNA đã tinh sạch từ Agarose gel, cho DNA và mồi ITS4 và ITS5 vào ống phản ứng sequences (0.5ml). Sau đó gửi đến hãng Macrogen của Hàn Quốc để thực hiện phản ứng giải trình tự và đọc trình tự gene.
Xác định nấm dựa vào trình tự vùng ITS (Khoảng 700bp)
Từ trình tự vùng gene ITS (khoảng 700 bp) nhận được từ Hãng Macrogen, chúng tôi tiến hành sử dụng dụng phần mềm BLAST trực tuyến trên NCBI (National Centerfor Biotechnology Information) để tìm kiếm các chuỗi gần gũi.
3.4.2.3. Phương pháp xác định bệnh virus trên thanh long
- Các mẫu virus giống triệu chứng thu được sử dụng để chiết RNA
- Chiết RNA tổng số: RNA tổng số được chiết dùng kít chiết thương mại RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN).
- Phản ứng RT-PCR: Được thực hiện với cặp mồi chung Potex 1 (CAY CAR CAR GCX AAR GAY SA) và potex 2 (TCD GTR TTD GCR TCR AAD GT) (Duarte et al., 2008). Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas.
3.4.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm
Nghiên cứu ảnh hưởng của các ngưỡng nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của nấm.
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PGA và đặt ở các ngưỡng nhiệt độ 15, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC. Mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri)
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy Ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến sự phát triển của nấm
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PGA và đặt ở các ngưỡng pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9. Mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri)
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy
3.4.2.5. Lây bệnh nhân tạo
- Thí nghiệm thực hiện trên cây thanh long khỏe, giống thanh long ruột đỏ Long Định (LĐ1): cành bánh tẻ.
- Sử dụng 2 phương pháp lây: lây sát thương châm kim (Hildebrand, 1953) và lây không sát thương bằng cách phun bào tử.
- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi và tính tỷ lệ bệnh trên các đoạn thân hặc quả đã lây:
Tổng số cành/quả bị bệnh
Tỷ lệ bệnh (%) = - - - x 100 Tổng số canh/quả lây nhiễm
3.4.2.6. Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc trừ nấm đối với bệnh nấm hại trên cây thanh long trong phòng thí nghiệm
- Sau khi xác định được loài nấm gây bệnh chính trên thanh long tại Quảng Ninh, chúng tôi đã lựa chọn 2 loại thuốc trừ bệnh (Anvil 5SC và Ridomil gold 68WP) để thử hiệu lực ức chế của thuốc đối với nấm trên môi trường PGA ở các nồng độ thuốc khác nhau: 0.01%, 0.03%, 0.05%, 0.1% và 0,3% (vì chưa có khuyến cáo sử dụng cho thanh long). Mỗi nồng độ thuốc thực hiện 3 lần nhắc lại.
- Thuốc được pha vào môi trường PGA ở các nồng độ như trên
- Sử dụng nguồn nấm thuần và cấy lên các đĩa PGA có chứa thuốc và đặt ở nhiệt độ 25 – 28oC.
- Theo dõi sự phát triển của nấm sau các ngày nuôi cấy ở các nồng độ thuốc khác nhau và tính hiệu lực của thuốc theo công thức Abbott:
C - T H(%) = --- C Trong đó:
H: là hiệu lực ức chế của thuốc trừ nấm
C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (không xử lý thuốc) T: Đường kính tản nấm ở công thức xử lý thuốc
3.4.3. Khảo sát khả năng phòng trừ của thuốc trừ bệnh đối với bệnh loét hại thanh long ngoài sản xuất thanh long ngoài sản xuất
Thí nghiệm được bố trí tại phường Cộng Hòa, Quảng Yên, Quảng Ninh. Thí nghiệm được khảo sát theo tiêu chuẩn cơ sở (TCCS 162:2014/BVTV) ban hành lần 1 của Cục Bảo vệ thực vật theo quyết định ban hành số 1263/QĐ-BVTV-KH ngày 31 tháng 7 năm 2014 về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ loét (Neoscytalidium dimidiatum) hại cây thanh long của các thuốc trừ bệnh.
- Thí nghiệm diện hẹp, phun 15 cây, không nhắc lại
- Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của bệnh (tính tỷ lệ bệnh) và tính hiệu lực của thuốc theo công thức Henderson-Tilton:
TaCb
HLPT (%) = 1 - --- x100 TbCa
Trong đó:
HLPT: Hiệu lực phòng trừ
Ta: Tỷ lệ bệnh ở công thức xử lý thuốc ở thời điểm sau khi phun thuốc Tb: Tỷ lệ bệnh ở công thức xử lý thuốc ở thời điểm trước khi phun thuốc Ca: Tỷ lệ bệnh ở công thức đối chứng sau xử lý thuốc
Cb: Tỷ lệ bệnh công thức đối chứng trước xử lý thuốc
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm thống kê sinh học IRRISTAT 5.0
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SẢN XUẤT THANH LONG TẠI QUẢNG NINH QUẢNG NINH
Theo số liệu ghi nhận của Sở nông nghiệp và Trung tâm Khuyến nông của tỉnh Quảng Ninh. Diện tích trồng thanh long (thanh long ruột trắng và ruột đỏ) trên địa bàn tỉnh tăng nhanh từ 100 ha (2012) đến 202,7 ha (2015). Thanh long được