Phần 3 Nguyên liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu theo QCVN 01- 04:2009/BNNPTNT
- Dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu: Kẹp, kéo, găng tay, áo bảo hộ. Khuôn lấy mẫu vô trùng, kích thước 5cm x 4cm. Ống nghiệm chứa dung dịch peptone. Thùng xốp chứa đá.
- Cách lấy mẫu thân thịt: chọn ngẫu nhiên tối thiểu 5 thân thịt (hoặc 5 nửa
thân thịt từ 5 thân thịt khác nhau) cho một lần lấy mẫu. Sử dụng dụng cụ khoan hoặc cắt vô trùng khoan (cắt) miếng mô mỏng, diện tích 5cm2 và độ dày tối đa 5mm tại bốn vị trí đã xác định trên mặt ngoài một nửa thân thịt. Tổng diện tích cắt từ 20cm2 đến 25cm2 tương đương 20g đến 30g thịt. Gộp các miếng mô vừa cắt thành một mẫu, cho vào túi đựng mẫu vô trùng hoặc đựng trong túi dùng để pha loãng và đồng nhất mẫu.
- Cách lấy mẫu bề mặt thân thịt: Sử dụng 10ml dung dịch pha loãng nước muối pepton (0,1% pepton + 0,85% NaCl) vô trùng làm ẩm miếng gạc, miếng mút hay tăm bông trước khi lấy mẫu. Vùng lấy mẫu phải bao trùm tối
thiểu 20 cm2 trên một vị trí lấy mẫu. Miếng hấp phụ phải được làm ẩm ít
nhất 5 giây trong dung dịch pha loãng. Sử dụng khuôn lấy mẫu định vị kích thước 5cm x 4cm và dùng kẹp vô trùng đặt miếng hấp phụ vào khuôn, sau đó di kẹp vô trùng trên bề mặt miếng hấp phụ theo chiều dọc, ngang, chéo trong khuôn mỗi chiều 10 lần, không ít hơn 20 giây. Cho miếng hấp phụ vào túi bằng chất dẻo vô trùng, thêm tiếp lượng dung dịch pha loãng nước muối pepton vô trùng sao cho đủ 25ml.
- Vị trí lấy mẫu lau(lau)
Hình 3.1. Đường đi và hướng lau dọc theo thân thịt khi lấy mẫu 3.3.2. Cách phân tích mẫu 3.3.2. Cách phân tích mẫu
3.3.2.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Chuẩn bị dịch cấy: chuẩn bị các dịch pha loãng thập phân bằng 90 ml
dịch pha loãng vô trùng (dung dịch đệm phosphat Butterfield) với 10 ml dung dịch mẫu pha loãng, trừ khi có quy định khác. Lắc tất cả các dịch pha loãng 25 lần theo dạng hình vòng cung 30 cm. Dùng pipet lấy chính xác thể tích cần thiết. Không dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 lần thể tích được lấy. Ví dụ: không dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 ml để phân phối 1 ml, không dùng pipet có dung tích lớn hơn 1 ml để phân phối thể tích 0,1 ml.
- Phương pháp xác định: Vị trí lấy mẫu (xem hình vẽ)
+ Vị trí 1: lấy mẫu ở vùng má + Vị trí 2: lấy mẫu ở vùng ngực + Vị trí 3: lấy mẫu ở vùng lưng + Vị trí 4: lấy mẫu ở vùng mông
+ Mở nắp đĩa Redigel vô trùng và rót khoảng từ 12 ml đến 15 ml dịch lỏng gel pectin từ chai vào đĩa. Đậy nắp đĩa và xoay đĩa để gel pectin phủ khắp đáy. Chuẩn bị một số lượng đĩa cần thiết cho các phần mẫu thử (hai đĩa cho mỗi dịch pha loãng). Các đĩa cần được sử dụng trong vòng 5 min sau khi đã rót gel pectin.
+ Cho 1 ml dịch cấy vào dịch lỏng gel pectin trong đĩa Redigel vô trùng. Chạm đầu tip pipet một lần vào điểm khô trên thành trong của đĩa (cao hơn mức của dịch pha loãng gel pectin) sau khi phân phối phần mẫu thử đến điểm ngừng trong tip pipet. Lắc đĩa ngay để trộn đều phần mẫu thử với gel pectin. Không để pectin tràn ra ngoài nữa.
+ Để yên các đĩa đã cấy trên mặt phẳng cho đến khi đông đặc (khoảng 30
min đến 40 min) sau đó ủ 48 h ± 2 h ở 35 oC ± 1oC đối với các sản phảm khác
với sữa và trong 48 h ± 3 h ở 32 oC ± 1 oC đối với các sản phẩm sữa.
+ Đếm các đĩa có số khuẩn lạc thích hợp (từ 30 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đối với các sản phẩm khác với sữa và từ 25 khuẩn lạc đến 250 khuẩn lạc đối với sản phẩm sữa). Nếu các đĩa không chứa số khuẩn lạc thích hợp đó thì ghi lại độ pha loãng và số khuẩn lạc đếm được. Kết quả được tính theo công thức:
d n n V C ml CFU X ) 1 , 0 ( ) / ( 2 1 Trong đó:
+ ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp nhau.
+ V: Thể tích mẫu (ml) cấy vào môi trường.
+ n1, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn. + d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất. + C.F.U (Colonies Forming Units ): số đơn vị khuẩn lạc.
- Biểu thị kết quả: ghi lại trung bình số đếm thu được là tổng số vi sinh vật hiếu khí đếm được trên gam hoặc mililit sản phẩm.
3.3.2.2. Xác định Coliforms
Chuẩn bị, pha loãng mẫu và đồng nhất mẫu: các bước tương tự như xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí.
tiếp, mỗi độ pha loãng nuối cấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng. Cho vào tâm của mỗi đĩa petri 1ml dung dịch mẫu thử. Rót 15ml môi
trường VRBL ở 440 C đến 470 C vào mỗi đĩa Petri. Thời gian từ khi kết thúc khâu
chuẩn bị huyền phù ban đầu đến thời điểm rót môi trường vào đĩa không vượt quá 15 phút.
Trộn đều dịch cấy với môi trường để cho hỗn hợp đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri ở một mặt phẳng ngang, mát.
Sau khi thạch đã đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL
ở 440 C đến 470 C lên mặt môi trường nuôi cấy. Để đông lại như mô tả ở trên.
Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm ở 300C hoặc 370C trong 24h ± 2h.
Đếm các khuẩn lạc: sau thời gian ủ qui định, chọn các đĩa Petri có từ 10 khuẩn lạc trở lên để đếm khuẩn lạc. Chọn các khuẩn lạc có màu đỏ ánh tía, có đường kính 0,1mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh).
Các khuẩn lạc này được coi là Coliform điển hình và không cần phải thử khẳng
định tiếp.
Khẳng định: cấy 5 khuẩn lạc của từng loại không điển hình, nếu sẵn có, cho vào các ống nghiệm canh thang Lactoza lục sáng. Ủ các ống nghiệm này
trong tủ ấm đặt ở 300C hoặc 370C trong 24h ± 2h. Các ống Durham cho thấy có
sinh khí thì được coi là có chứa Coliform.
Tính kết quả: Cứ sau 24h đếm sơ bộ số khuẩn lạc đã mọc và sau 72h đếm chính thức để tính kết quả.
Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan nghịch giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.
Đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa Petri, chỉ đếm những đĩa có số khuẩn lạc mọc riêng biệt và từ 15 đến 300 khuẩn lạc.
Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa, trong trường hợp số lượng khuẩn lạc lớn và phân bố đều, có thể phần đáy đĩa theo đường kính thành các phần đều nhau có bội số là 2 để đếm một phần sau đó nhân kết quả với tổng số phần đã chia.
Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X1) được quy ra tổng số vi
khuẩn hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được tính ở 2 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:
X1 = xd n n C ) . 1 , 0 ( 1 2 Trong đó:
C - tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp được đếm
n1 - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm
n2 - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ hai được đếm
d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được đếm.
Kết quả được làm tròn tới số hàng nghìn và biểu thị dưới dạng tích của
một số thập phân hai chữ số (1,0 ….9,9) với 10n (n = số chữ số nguyên của kết
quả trừ 1).
3.3.2.3. Xác định E.coli
Chuẩn bị, pha loãng mẫu và đồng nhất mẫu: tương tự như xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt.
Tiến hành nuôi cấy: Cấy 0,1ml dung dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng thích hợp lên các đĩa kép có chứa môi trường TBX (trypton – mật -
glucuronid). Các đĩa này được ủ ở 440C ± 10C trong 18h đến 24h rồi kiểm tra
để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng được coi là E.coli dương
tính với β-glucuronidaza.
Tính kết quả: Sau giai đoạn ủ ấm theo qui định, đếm các CFU điển hình của E.coli dương tính với β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình). N là
số lượng E.coli dương tính với β-glucuronidaza có mặt trong mẫu thử trên mililit
sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp sử dụng công thức.
N= xd n n Vx a ) . 1 , 0 ( 1 2 Trong đó:
∑ a: là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp
n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất
n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai
V: thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
3.3.2.4. Xác định Salmonella
Phương pháp xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella được thực hiện theo
qui trình sau:
Pha loãng mẫu theo bậc pha loãng thập phân: 10-1, 10-2,…10-4
↓
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 1ml dung dịch pha loãng mẫu nồng độ 10-1
sang 10ml môi trường tăng sinh Muller Kauffman, ủ ở 370C/24h
↓
Phân lập và nhận diện: Cấy 0,1ml dịch tăng sinh
trên 2 môi trường chọn lọc XLT4 và BGA, ủ ở 370C/24h
+ Trên môi trường XLT4: Khuẩn lạc đen bóng, rìa gọn
+ Trên môi trường BGA: Khuẩn lạc màu hồng sáng ↓
Khẳng định bằng cách thử đặc tính sinh hóa:
- Cấy chuyển sang môi trường TSI: phần thạch nghiêng màu
đỏ, thạch đứng màu vàng, sinh H2S, sinh hơi
- Thử nghiệm IMVC cho kết quả (- + - +)
↓
Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella
3.3.3. Phương pháp điều tra
Lập bộ câu hỏi điều tra thu thập số liệu về thực trạng hoạt động giết mổ; phỏng vấn những người liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài. Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn để tính số liệu điều tra (phụ lục 2).
3.3.4. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật trên bề mặt sàn của điểm giết mổ
- Lấy mẫu: Dùng tăm bông vô trùng, lau nền sàn. Diện tích cần lau là
20cm2. Sau đó lấy các đầu tăm bông, cho vào bình tam giác chứa 100ml nước
sinh lý 0.85%, đồng nhất thu được dung dịch huyền phù ban đầu. Tiếp tục pha
- Phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí trên bề mặt nền: TCVN 7928:2008.
- Phương pháp kiểm tra Coliforms tổng số trên bề mặt nền: TCVN
6848:2007 (ISO 4832:2007).
- Phương pháp kiểm tra E.coli tổng số trên bề mặt nền: TCVN 7924-
1:2008 (ISO 16649:2001).
- Phương pháp kiểm tra Salmonella tổng số trên bề mặt nền: TCVN
4829:2005 sửa đổi 1:2008.
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm Excel, Minitab 16.