3.5.5.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh Theo cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
Chuẩn bị:
Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm
đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, đĩa môi trường Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl 1-2%
Trình tự:
3. Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới
4. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát bằng nước vòi (đặc biệt là các mẫu rễ) 5. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp
6. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl 1-2 %. Thời gian khử trùng từ 1-3 phút tùy vật liệu cây.
7. Rửa lại bằng nước cất vô trùng
8. Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng
9. Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WA.
10. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây, bệnh...
11. Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm.
12. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PGA.
3.5.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm - Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết. Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗ đục 5mm) trên các môi trường PGA, WA.
- Đối với mỗi loài nấm bệnh tiến hành thí nghiệm với 2 công thức là trên môi trường PGA và WA, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Theo dõi trong vòng 5 ngày.
3.5.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến sự phát triển của nấm trong phòng thí nghiệmtheo phương pháp của Uesugi Yasuhiko
- Môi trường thử thuốc: Cân thuốc theo lượng đã tính phù hợp với nồng độ cần pha, để thuốc vào trong bình tam giác hoặc cốc đong có định mức, đổ lượng nước cất vô trùng theo lượng cần để tạo ra dung dịch mẹ có nồng độ xác định. Ví dụ: Đối với thuốc Daconil 75WP, cân 1g thuốc pha với 75ml nước cất vô trùng sẽ tạo ra dung dịch mẹ nồng độ 10 000 ppm. Dùng xi lanh hoặc pipet hút 1ml dung dịch mẹ cho vào bình định mức có 100ml dung dịch môi trường PGA lỏng đã được hấp, khử trùng sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 100ppm, 2ml dung dịch mẹ cho 100ml dung dịch môi trường sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 200ppm…
- Thí nghiệm đc tiến hành trên 3 loại thuốc Anvil 5SC, Daconil 75WP, Tepro Super 300EC với 4 công thức
+ CT1: nồng độ 50ppm + CT2: nồng độ 100ppm + CT3: nồng độ 200ppm
+ CT4: Đối chứng (Môi trường PGA không xử lý thuốc)
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần là một hộp lồng đĩa petri, - Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm trung bình sau cấy trong 5 ngày (Đơn vị đo mm)
* Công thức pha chế dung dịch mẹ để thử thuốc trừ nấm trên môi trường nhân tạo PGA
+ Pha dung dịch mẹ
P (g) (WP) = a µai/ml x b ml x 100 106
Trong đó: 1 µai/ml = 1ppm = 106 b ml: Nước cất vô trùng
+ Tính lượng ml dung dịch mẹ cần lấy cho vào môi trường ở nồng độ cần có X ml = C µai/ml x ml môi trường
M µai/ml
Trong đó: C giá trị ko đổi P(g) (WP)
3.5.5.4. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Phương pháp thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo kiểu Khối ngẫu nhiên đấy đủ RCB, Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại với vết bệnh trên lá là 10 vết, lây nhiễm toàn cây là 10 cây. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các công thức thí nghiệm: Một số giống ngô chính được trồng tại Yên Bái và bệnh nấm hại lá chủ yếu trên ngô thu được.
a. Phương pháp lây bệnh nhân tạo các bệnh nấm hại lá chính trên ngô bằng phương pháp phun bào tử
* Chuẩn bị nguồn và ký chủ.
- Nguồn nấm gây bệnh: Trên lá ngô được phân lập từ mẫu ngô bị bệnh nuôi cấy trên môi trường PGA hình thành bào tử. Dùng que cấy nấm khêu bào tử từ môi trường nuôi cấy hòa loãng vào nước cất vô trùng, đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm dưới kính hiển quang học với số lượng 104 - 105 bào tử/ml (tương đương 50 bào tử trên 1 quang trường kính hiển vi)
- Ký chủ lây bệnh
+ Các giống ngô: HN68, LVN885, DK6919 + Giai đoạn lây bệnh: ngô ở giai đoạn 7-8 lá thật.
* Phương pháp lây bệnh:
Dùng bình xịt tay để dạng phun sương để phun dung dịch có chứa bào tử nấm cần lây bệnh. Phun vào chiều tối và để cây đã phun ra ngoài tạo điều kiện ẩm độ tốt cho bào tử nấm nảy mầm và xâm nhiễm (chú ý cách ly công thức lây bệnh và công thức đối chứng vì bào tử nấm có thể bay trong không khí ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm).
* Chỉ tiêu theo dõi: Số vết đốm hình thành trên các giống ngô sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày.
b. Phương pháp lây bệnh nhân tạo các bệnh nấm hại lá chính trên ngô bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp sợi nấm
* Chuẩn bị nguồn và ký chủ lây bệnh như phương pháp lây nhiễm bằng phương pháp phun bào tử.
* Phương pháp lây nhiễm:
+ Chuẩn bị nguồn nấm được cấy trên môi trường PGA và bang dính để thực hiện lây bệnh trực tiếp
+ Dùng que khêu lấy miếng thạch có phần tản nấm gây bệnh sau đó dùng miếng thạch đó gắn vào lá cây ký chủ. Mỗi công thức thực hiện 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại là 10 vết lây nhiễm, sau đó dùng băng dính cố định lại và dán nhãn. Công thức đối chứng không lây nhiễm nấm bệnh.
* Chỉ tiêu theo dõi: để đánh giá mức kháng nhiễm khác nhau của các giống trong mỗi công thức (đối với đốm lá nhỏ ta xác định, bán kính quầng vết bệnh và chiều dài vết bệnh, đơn vị là mm. đối với đốm lá lớn chi xác định kích thước vết bệnh là chiều dài vết bệnh, đơn vị là mm) qua 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày.