3.3.1. Vật liệu
- Giống ngô: DK6919, HN68, LVN885.
- Nguồn nấm lây bệnh: Các bệnh nấm hại chủ yếu trên lá ngô tại Văn Yên, Yên Bái.
- Các loại thuốc Anvil 5SC (Hexaconazole), Daconil 75WP (Chlorothalonil), Tepro Super 300EC (Tebuconazole + Propiconazole).
- Môi trường nuôi cấy WA, PGA
- Các hóa chất trong phòng thí nghiệm: cồn, axit acetic (CH3COOH), natrihydroxit (NaOH),…
3.3.2. Dụng cụ
- Các dụng cụ cần trong phòng thí nghiệm: tủ định ôn, tủ sấy, buồng cấy vô trùng, kính hiển vi, lam kính, lamen, đĩa petri, đũa thủy tinh, ống đong, que cấy, dao,...
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra các bệnh hại do nấm gây ra trên lá ngô tại huyện Văn Yên, Tỉnh Yên Bái.
- Xác định, chuẩn đoán tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu được trong quá trình điều tra bằng trực tiếp và phân lập trên môi trường nhân tạo.
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô.
- Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học trên môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô.
- Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp phun bào tử và lây nhiễm trực tiếp sợi nấm gây bệnh đốm lá lớn, đốm lá nhỏ và gỉ sắt trên các giống: DK6919, HN68, LVN885.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra bệnh theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây ngô QCVN 01-167:2014/BNNPTNT ban hành năm 2014
3.5.1.1. Bệnh trên lá (đốm lá lớn, đốm lá nhỏ, gỉ sắt)
Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 10 lá ngẫu nhiên/điểm. Cách điều tra
Mỗi điểm chọn 10 lá ngẫu nhiên (lá non, lá bánh tẻ, lá già), đếm số lá bị bệnh và phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp:
Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh; Cấp 3: từ 1 – 5% diện tích lá bị bệnh; Cấp 5: > 5 – 25% diện tích lá bị bệnh; Cấp 7: > 25 – 50% diện tích lá bị bệnh; Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh. 3.5.1.2. Bệnh trên thân (Bệnh khô vằn ngô):
Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 30 cây/ điểm, phân cấp bệnh theo thang 9 cấp:
Cấp 1: < 1/4 diện tích bẹ lá bị hại.
Cấp 3: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại.
Cấp 5: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại, cộng lá thứ 3, thứ 4 bị bệnh nhẹ. Cấp 7: > 1/2 đến 3/4 diện tích bẹ lá bị hại và lá phía trên bị hại.
Cấp 9: Vết bệnh leo tới đỉnh cây, các lá nhiễm nặng, một số cây chết. Các chỉ tiêu cần theo dõi
- Tỷ lệ, chỉ số bệnh (%) - Cấp bệnh phổ biến;
Tỷ lệ bệnh (%) = Tổng số lá bị bệnh x 100 Tổng số lá điều tra Chỉ số bệnh (%) = (N1 x 1) + (N3 x 3) + …+ (Nn x n) x 100 N x n Trong đó: N1 là số cây bị bệnh ở cấp 1; N3 là số cây bị bệnh ở cấp 3; Nn là số cây bị bệnh ở cấp n; N: là tổng số cây điều tra;
n: là cấp bệnh cao nhất trong thang phân cấp (cấp 9).
3.5.2.Phương pháp điều chế môi trường phân lập nấm
1. Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh (đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lọ nắp nhựa chuyên dụng...): có thể khử trùng bằng hoá chất hoặc sấy ở nhiệt độ cao. Sấy ở nhiệt độ cao thông dụng hơn.
Dụng cụ thuỷ tinh rửa sạch bằng xà phòng, rửa lại bằng nước vòi Phơi khô trên giá, đóng gói bằng giấy bạc bọc thực phẩm.
Cho vào tủ sấy, sấy ở 1500C trong 3 giờ
2. Rót môi trường ra đĩa petri: Thao tác cần được thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo vô trùng.
Môi trường cần được để nguội khoảng 55-600C
Rót môi trường dầy khoảng 5 mm (20ml môi trường/đĩa petri 9cm) Để bề mặt môi trường khô (khoảng 20 phút) trước khi đậy nắp đĩa.
3. Các loại môi trường dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm Môi trường WA
Môi trường WA (Water agar): đun 15g agar trong 800 ml nước cho tan thạch. Bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút, để nguội khoảng 55-600C trước khi rót ra đĩa.
Rót môi trường WA đã khử trùng vào đĩa petri Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)
Khoai tây: 200g Glucose: 20 g Agar: 20 g
Khoai tây rửa sạch, cắt lát, đun trong nước 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung agar vào dịch lọc, đun cho tan agar. Bổ sung nước cất cho đủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút. Để nguội 55-600C trước khi rót ra đĩa petri.
(Chú ý, môi trường PGA rất giàu carbonhydrate. Do vậy, để giảm sự sinh trưởng của nấm và tăng sự sinh bào tử có thể giảm lượng khoai tây và đường từ 50%-75%).
3.5.3. Phương pháp thu thập mẫu
Với những mẫu nấm gây bệnh trên lá: gỉ sắt Puccinia maydis, đốm lá lớn
E.turcicum, đốm lá nhỏ Bipolaris maydis… cho mẫu lá bị bệnh vào hộp mẫu, lưu trữ trong tủ mát và phân lập trong vòng 48h.
3.5.4. Phương pháp kiểm tra nấm từ vết bệnh
3.5.4.1. Kiểm tra trực tiếp vết bệnh (thích hợp cho các mô mỏng như lá cây) Chuẩn bị một lam sạch
Cắt vết bệnh cần quan sát thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1-2 cm. Mẫu bệnh có thể được quan sát ngay sau khi thu thập ngoài đồng hoặc để ẩm trong hộp petri từ hôm trước.
Đặt tiêu bản lên lam sao cho phần vết bệnh hướng lên trên.
Điều chỉnh kính để có ánh sáng tối đa và quan sát ở độ phóng đại thấp (vật kính: x4, x10, x40).
Chú ý: Không nên cắt quá nhỏ mẫu bệnh và cần quan sát nhanh vì dưới cường độ ánh sáng mạnh, mẫu sẽ nhanh bị khô.
3.5.4.2. Kiểm tra nấm bệnh bằng cố định lam
Chuẩn bị: lam, la men, que khêu nấm, dao mổ, nước cất vô trùng, mẫu bệnh. Mẫu bệnh (mẫu lá) có thể được sử dụng ngay sau khi thu thập hoặc để ẩm.
Nhỏ một giọt nước cất lên lam
Dùng que khêu nấm hoặc dao mổ lướt nhẹ đầu nhọn trên vết bệnh, nhúng vào trong giọt nước trên lam và khuấy nhẹ. Nhẹ nhàng đậy la men lên trên giọt nước (cố gắng tránh để có bọt khí). Dùng giấy thấm hút nước thừa xung quanh la men.
3.5.5. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.5.1. Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh Theo cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam
Chuẩn bị:
Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm
đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, đĩa môi trường Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl 1-2%
Trình tự:
3. Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới
4. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát bằng nước vòi (đặc biệt là các mẫu rễ) 5. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp
6. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl 1-2 %. Thời gian khử trùng từ 1-3 phút tùy vật liệu cây.
7. Rửa lại bằng nước cất vô trùng
8. Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng
9. Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WA.
10. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây, bệnh...
11. Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm.
12. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PGA.
3.5.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm - Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết. Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗ đục 5mm) trên các môi trường PGA, WA.
- Đối với mỗi loài nấm bệnh tiến hành thí nghiệm với 2 công thức là trên môi trường PGA và WA, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. Theo dõi trong vòng 5 ngày.
3.5.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến sự phát triển của nấm trong phòng thí nghiệmtheo phương pháp của Uesugi Yasuhiko
- Môi trường thử thuốc: Cân thuốc theo lượng đã tính phù hợp với nồng độ cần pha, để thuốc vào trong bình tam giác hoặc cốc đong có định mức, đổ lượng nước cất vô trùng theo lượng cần để tạo ra dung dịch mẹ có nồng độ xác định. Ví dụ: Đối với thuốc Daconil 75WP, cân 1g thuốc pha với 75ml nước cất vô trùng sẽ tạo ra dung dịch mẹ nồng độ 10 000 ppm. Dùng xi lanh hoặc pipet hút 1ml dung dịch mẹ cho vào bình định mức có 100ml dung dịch môi trường PGA lỏng đã được hấp, khử trùng sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 100ppm, 2ml dung dịch mẹ cho 100ml dung dịch môi trường sẽ tạo được dung dịch có nồng độ thuốc là 200ppm…
- Thí nghiệm đc tiến hành trên 3 loại thuốc Anvil 5SC, Daconil 75WP, Tepro Super 300EC với 4 công thức
+ CT1: nồng độ 50ppm + CT2: nồng độ 100ppm + CT3: nồng độ 200ppm
+ CT4: Đối chứng (Môi trường PGA không xử lý thuốc)
Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần là một hộp lồng đĩa petri, - Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm trung bình sau cấy trong 5 ngày (Đơn vị đo mm)
* Công thức pha chế dung dịch mẹ để thử thuốc trừ nấm trên môi trường nhân tạo PGA
+ Pha dung dịch mẹ
P (g) (WP) = a µai/ml x b ml x 100 106
Trong đó: 1 µai/ml = 1ppm = 106 b ml: Nước cất vô trùng
+ Tính lượng ml dung dịch mẹ cần lấy cho vào môi trường ở nồng độ cần có X ml = C µai/ml x ml môi trường
M µai/ml
Trong đó: C giá trị ko đổi P(g) (WP)
3.5.5.4. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Phương pháp thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế theo kiểu Khối ngẫu nhiên đấy đủ RCB, Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại với vết bệnh trên lá là 10 vết, lây nhiễm toàn cây là 10 cây.
Các công thức thí nghiệm: Một số giống ngô chính được trồng tại Yên Bái và bệnh nấm hại lá chủ yếu trên ngô thu được.
a. Phương pháp lây bệnh nhân tạo các bệnh nấm hại lá chính trên ngô bằng phương pháp phun bào tử
* Chuẩn bị nguồn và ký chủ.
- Nguồn nấm gây bệnh: Trên lá ngô được phân lập từ mẫu ngô bị bệnh nuôi cấy trên môi trường PGA hình thành bào tử. Dùng que cấy nấm khêu bào tử từ môi trường nuôi cấy hòa loãng vào nước cất vô trùng, đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm dưới kính hiển quang học với số lượng 104 - 105 bào tử/ml (tương đương 50 bào tử trên 1 quang trường kính hiển vi)
- Ký chủ lây bệnh
+ Các giống ngô: HN68, LVN885, DK6919 + Giai đoạn lây bệnh: ngô ở giai đoạn 7-8 lá thật.
* Phương pháp lây bệnh:
Dùng bình xịt tay để dạng phun sương để phun dung dịch có chứa bào tử nấm cần lây bệnh. Phun vào chiều tối và để cây đã phun ra ngoài tạo điều kiện ẩm độ tốt cho bào tử nấm nảy mầm và xâm nhiễm (chú ý cách ly công thức lây bệnh và công thức đối chứng vì bào tử nấm có thể bay trong không khí ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm).
* Chỉ tiêu theo dõi: Số vết đốm hình thành trên các giống ngô sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày.
b. Phương pháp lây bệnh nhân tạo các bệnh nấm hại lá chính trên ngô bằng phương pháp lây nhiễm trực tiếp sợi nấm
* Chuẩn bị nguồn và ký chủ lây bệnh như phương pháp lây nhiễm bằng phương pháp phun bào tử.
* Phương pháp lây nhiễm:
+ Chuẩn bị nguồn nấm được cấy trên môi trường PGA và bang dính để thực hiện lây bệnh trực tiếp
+ Dùng que khêu lấy miếng thạch có phần tản nấm gây bệnh sau đó dùng miếng thạch đó gắn vào lá cây ký chủ. Mỗi công thức thực hiện 3 lần nhắc lại mỗi lần nhắc lại là 10 vết lây nhiễm, sau đó dùng băng dính cố định lại và dán nhãn. Công thức đối chứng không lây nhiễm nấm bệnh.
* Chỉ tiêu theo dõi: để đánh giá mức kháng nhiễm khác nhau của các giống trong mỗi công thức (đối với đốm lá nhỏ ta xác định, bán kính quầng vết bệnh và chiều dài vết bệnh, đơn vị là mm. đối với đốm lá lớn chi xác định kích thước vết bệnh là chiều dài vết bệnh, đơn vị là mm) qua 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày.
3.5.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thu thập đánh giá và xử lý bằng Microsoft EXCEL và phần mềm thống kê IRRI START 5.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. THÀNH PHẦN NẤM BỆNH HẠI NGÔ TẠI HUYỆN VĂN YÊN, TỈNH YÊN BÁI VỤ ĐÔNG XUÂN 2016 - 2017 YÊN BÁI VỤ ĐÔNG XUÂN 2016 - 2017
Trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi tiến hành điều tra từ cuối tháng 9 năm 2016 đến giữa tháng 12 năm 2016 tại các xã có diện tích trồng ngô lớn của huyện Văn Yên, Yên Bái.
Chúng tôi đã xác định được thành phần một số nấm bệnh hại trên ngô tại huyện Văn Yên, Yên Bái vụ Đông 2016. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Thành phần nấm bệnh hại ngô tại huyện Văn Yên, Yên Bái vụ Đông xuân 2016 - 2017 STT Tên bệnh Tên khoa học Thời kỳ xuất hiện bệnh Mức độ phổ biến Bộ phận bị hại 1 Đốm lá nhỏ Bipolaris Maydis Cây con 3- 4 lá thật +++ Phiến lá, bẹ lá, áo bắp 2 Đốm lá lớn Exserohilum turcicum Cây 7-8 lá thật +++ Phiến lá, bẹ lá, áo bắp 3 Gỉ sắt Puccinia maydis
Cuối giai đoạn
sinh trưởng ++
Phiến lá, bẹ lá, áo bắp
4 Khô vằn Rhizoctonia
solani
Cây con – thu
hoạch +++ Phiến lá, bẹ lá, thân, áo bắp 5 Bạch tạng Sclerospora maydis Cây con 3-8 lá thật + Phiến lá, bẹ lá, thân 6 Ung thư ngô Ustilago maydis Cây 7-8 lá thật và cuối giai đoạn sinh trưởng + Thân, lá, bẹ lá, bắp Ghi chú: + : TLB < 5% ++: TLB ≥ 5 – 15% +++: TLB ≥ 15 – 25 %
Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy có 6 loài nấm hại trên ngô vụ đông trên địa bàn huyện Văn Yên năm 2016 với các mức độ nặng nhẹ khác nhau.
Xuất hiện phổ biến với tỷ lệ bệnh > 15% trong số các bệnh gây hại trên cây ngô là bệnh đốm lá bao gồm 2 bệnh đốm lớn do nấm Exserohilum turcicum,
đốm lá nhỏ do nấm Bipolaris maydis gây ra và bệnh Khô vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra. Bệnh ít phổ biến hơn (với tỷ lệ bệnh 5 -15 %) là bệnh gỉ sắt hại ngô (Puccinia maydis). Ngoài ra còn có bệnh xuất hiện ít trên các vùng trồng ngô(TLB < 5%) là bệnh bạch tạng do nấm Sclerospora maydis gây ra và vào cuối giai đoạn sinh trưởng là bệnh ung thư ngô (Ustilago maydis).
Trong quá trình điều tra và giám định bệnh hại trên ngô chúng tôi thấy Các bệnh khác nhau biểu hiện triệu chứng và giai đoạn gây bệnh trên cây ngô là khác nhau. Do vây, nhận biết từng loài bệnh gây hại trên cây ngô là rất cần thiết với mục đích đó chúng tôi giám định từng loài bệnh trên với triệu chứng và giai đoạn gây hại chính trên cây ngô như sau:
4.1.1. Bệnh đốm lá ngô
Nấm Exserohilum turcicum gây bệnh đốm lá lớn ngô. Nấm Bipolaris Maydis gây bệnh đốm lá nhỏ ngô.
Bệnh đốm lá nhỏ và đốm lá lớn trên ngô có triệu chứng khác nhau, tuy nhiên cả hai bệnh này đều xuất hiện và gây hại chủ yếu ở phiến lá và ở bắp hạt. 4.1.1.1. Bệnh đốm lá nhỏ
Có vết bệnh nhỏ như mũi kim, hơi vàng sau đó lớn rộng ra thành hình tròn hoặc bầu dục nhỏ, kích thước vết bệnh khoảng 5 - 6 x 1,5mm, màu nâu hoặc ở giữa hơi xám, có viền nâu đỏ, nhiều khi vết bệnh có màu quầng vàng. Bệnh hại ở lá, bẹ lá và hạt.
4.1.1.2. Bệnh đốm lá lớn
Hình 4.2. Triệu chứng bệnh đốm lá lớn Exserohilum turcicum
Có vết bệnh khác hẳn: vết bệnh dài có dạng sọc hình thoi không đều đặn,