Callus
SKTB/MT lỏng
- Môi tr−ờng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/), saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Nuôi trong điều kiện: t0= 22-240C; thời 35 ngày; không có ánh sáng. Cấy chuyển 4 lần
Duy trì nuôi cấy trong môi tr−ờng thạch
Thông đỏ tự nhiên
- Tiệt khuẩn mẫu cây bằng HgCl + Tween 80
- Cấy vào MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l), saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Điều kiện nuôi cấy: 35 ngày, nhiệt độ240C, không có ánh sáng
Tạo callus
Nuôi cấy
trên môi tr−ờng lỏng
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l).
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 130 v/phút, thời gian:14 ngày
Callus/MT thạch
Sinh khối/ Bioreactor
- Lọc lấy tế bào
- Rửa 3 lần với n−ớc cất
- Sấy khô 40 -600C/10giờ
Thu sinh khối
SKTB khô
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l+20g/l ở ngày thứ 10), thêm MJ (100àM) ngày thứ 12
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời gian:17 ngày
Nuôi cấy trong hệ thống bioreactor 5 lít
3.2. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU THÀNH PHẦN HểA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIấU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIấU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THễNG ĐỎ
3.2.1. Xỏc định thành phần húa học trong sinh khối tế bào thụng đỏ
3.2.1.1. Xõy dựng phương phỏp định tớnh và định lượng cỏc hoạt chất
trong sinh khối tế bào thụng đỏ bằng HPLC
* Kết quả xõy dựng phương phỏp xử lý mẫu
- Chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung mụi methanol - dicloromethan (3:1, tt/tt), chiết nhiều lần, rồi phõn tớch ngay bằng HPLC.
- Chiết lỏng - rắn với dung mụi chiết methanol, chiết nhiều lần, sau đú tinh chế bằng cột chiết pha rắn trước khi chạy HPLC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả sắc ký đồ của 2 phương phỏp xử lý mẫu thể hiện ở hỡnh 3.10 a và 3.10 b cho thấy: mặc dự phương phỏp chiết lỏng – lỏng cũn nhiều tạp hơn so với phương phỏp chiết pha rắn nhưng sắc ký đồ vẫn tỏch ra được pic quan trọng paclitaxel và baccatin III. Phương phỏp chiết pha rắn loại tạp tốt hơn nhưng phương phỏp này cú hạn chế là tốn nhiều thời gian và giỏ thành cao, trong khi cú rất nhiều mẫu sinh khối phải phõn tớch. Vỡ vậy, phương phỏp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng được lựa chọn cho nghiờn cứu tiếp theo.
AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
Baccatin III Paclitaxel AU
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Minutes 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Baccatin III Paclitaxel