Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thụng đỏ được tiến hành theo cỏc nguyờn tắc của Enaksha, Parc, Cusido [42], [48], [120]. Cành non thụng đỏ được xử lý tiệt khuẩn, cắt thành lỏt nhỏ, cấy vào mụi trường thạch để tạo callus. Sau khi tạo thành, callus sẽ được duy trỡ nuụi cấy trong mụi trường thạch. Quỏ trỡnh nuụi cấy tạo và duy trỡ callus trong mụi trường thạch cần phải xỏc định được mụi trường, thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ chất kớch thớch sinh trưởng phự hợp. Sau đú, cấy chuyển tế bào sang mụi trường lỏng cú sử dụng mỏy lắc. Ở giai đoạn này, cần xỏc định thời gian, pH, nhiệt độ, chất kớch thớch sinh trưởng phự hợp cho sinh khối thụng đỏ phỏt triển. Đồng thời, cần xỏc định được loại, nồng độ, thời điểm cho tiếp xỳc, thời gian tiếp xỳc với chất kớch thớch làm tăng hoạt chất. Sau khi đó xỏc định được mụi trường và điều kiện nuụi cấy tốt nhất, phỏt triển qui mụ nuụi cấy lờn hệ thống bỡnh nuụi cấy với cỏc điều kiện như trong mụi trường lỏng. Thu hoạch sinh khối nghiờn cứu
thành phần húa học, chiết xuất, phõn lập và nhận dạng cỏc hoạt chất, xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở của nguyờn liệu và hoạt chất.
2.2.1.1. Nuụi cấy tạo callus thụng đỏ
Nuụi cấy callus thụng đỏ được tiến hành theo phương phỏp của Enaksha và cs [48] gồm cỏc bước cơ bản sau:
- Chuẩn bị mụi trường nuụi cấy. - Vụ trựng mẫu cấy.
- Tỏch cỏc mụ ra khỏi mẫu cấy.
- Cấy mẫu vào mụi trường nuụi cấy khảo sỏt.
- Nuụi cấy trong mụi trường thạch ở điều kiện vụ khuẩn và khụng cú ỏnh sỏng.
Đỏnh giỏ: khảo sỏt khả năng tạo callus trờn cỏc mụi trường khỏc nhau dựa trờn cỏc chỉ tiờu:
+ Hỡnh thỏi của callus: tế bào phỏt triển đều, sỏng màu, khụng bị nhiễm nấm mốc.
+ Khối lượng callus khụ.
Để xõy dựng quy trỡnh nuụi cấy tạo callus thụng đỏ, khảo sỏt cỏc thụng số sau:
- Khảo sỏt lựa chọn chất sỏt khuẩn mẫu tự nhiờn
- Khảo sỏt thời gian tiệt khuẩn mẫu
- Khảo sỏt lựa chọn mụi trường nuụi cấy tạo callus thụng đỏ - Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy
- Khảo sỏt ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh trưởng
2.2.1.2. Duy trỡ nuụi cấy callus trong mụi trường thạch.
Callus sau khi tạo được trong mụi trường thớch hợp, tiến hành cấy chuyển trong mụi trường thạch nhằm mục đớch cho tế bào phỏt triển nhanh, thớch nghi với mụi trường, đồng thời hạn chế quỏ trỡnh biệt húa của tế bào mụ, cỏc tổ chức [48], [52]. Cỏc bước tiến hành gồm:
- Cấy callus vào trong mụi trường.
- Nuụi cấy trong điều kiện vụ khuẩn, khụng ỏnh sỏng ở nhiệt độ thớch hợp. Sau từng khoảng thời gian nhất định lấy mẫu ra kiểm tra và đỏnh giỏ theo cỏc chỉ tiờu.
* Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ: Hỡnh thức tế bào, khối lượng tế bào khụ, tỷ lệ tăng trưởng (là tỷ lệ giữa khối lượng (g) tế bào khụ thu hoạch trờn khối lượng (g) tế bào đưa vào nuụi cấy ban đầu).
Trong giai đoạn này, tiến hành khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng tới sự phỏt triển của callus và khả năng biệt húa [38], [90], [102] bao gồm:
- Đỏnh giỏ sự thớch nghi của callus thụng đỏ trong mụi trường thạch - Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ saccharose
- Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy
- Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy
2.2.1.3. Nghiờn cứu nuụi cấy tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
Nuụi cấy sinh khối tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng dựa theo phương phỏp mụ tả của Khosroushahi và Yan [72], [138].
- Chuẩn bị mụi trường lỏng để nuụi cấy
- Cấy tế bào vào mụi trường lỏng với tỷ lệ nhất định. - Nuụi trong điều kiện vụ khuẩn, khụng cú ỏnh sỏng.
- Sau khoảng thời gian nuụi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch, sấy khụ, đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu.
* Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ: khối lượng tế bào thụng đỏ khụ (sấy khụ tế bào thụng đỏ ở 450C đến khối lượng khụng đổi). Qui đổi số gam tế bào khụ trong 1 lớt mụi trường (g/l); tỷ lệ sinh trưởng (khối lượng tế bào khụ thu được sau khi nuụi cấy so với khối lượng tế bào cho vào ban đầu).
Trong giai đoạn này, khảo sỏt ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phỏt triển cũng như hàm lượng hoạt chất trong tế bào:
- Đỏnh giỏ khả năng thớch nghi của tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy đến sự phỏt triển của tế bào trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy đến sự phỏt triển của tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy đến sự phỏt triển khối tế bào thụng đỏ
- Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phỏt triển tế bào thụng đỏ - Khảo sỏt lựa chọn chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp để nuụi cấy tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng: lựa chọn loại chất kớch thớch sinh trưởng; lựa chọn nồng độ chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp
2.2.1.4. Nghiờn cứu ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất
trong nuụi cấy tế bào thụng đỏ
Khảo sỏt cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) trong nuụi cấy tế bào thụng đỏ được tiến hành theo phương phỏp của Luo và Moon [90], [97].
- Chuẩn bị mụi trường nuụi cấy
- Cấy tế bào vào mụi trường, nuụi cấy trong điều kiện xỏc định
- Bổ sung elicitor vào mụi trường nuụi cấy ở thời điểm nhất định, tiếp tục nuụi cấy
- Sau khoảng thời gian nuụi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch, sấy khụ, đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu:
- Chỉ tiờu đỏnh giỏ: khối lượng tế bào khụ (g/l) và hàm lượng hoạt chất chớnh paclitaxel trong tế bào.
- Định lượng paclitaxel trong sinh khối bằng phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (phương phỏp định lượng đó được nghiờn cứu xõy dựng và thẩm định, sẽ trỡnh bày ở phần sau của luận ỏn)
Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu, khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phỏt triển tế bào và hàm lượng paclitaxel [50], [72], [91], [146] gồm:
- Khảo sỏt lựa chọn nồng độ chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất trong sinh khối tế bào thụng đỏ
- Khảo sỏt thời điểm cho tế bào thụng đỏ tiếp xỳc với elicitor - Khảo sỏt lựa chọn thời gian cho tế bào tiếp xỳc với elicitor
- Khảo sỏt kết hợp bổ sung đường vào giữa chu kỳ nuụi cấy với elicitor - Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung giữa chu kỳ nuụi cấy.
2.2.1.5. Nuụi cấy trờn hệ thống bỡnh nuụi cấy 5 lớt
Sau khi đó khảo sỏt lựa chọn được cỏc điều kiện nuụi cấy, cũng như thành phần mụi trường cho nuụi cấy tế bào thụng đỏ, tiến hành cấy chuyển cỏc tế bào từ cỏc bỡnh nún trờn mỏy lắc như trờn sang hệ thống bỡnh nuụi cấy 5 lớt [141]. Sau thời gian nuụi cấy xỏc định, bổ sung thờm đường và elicitor thớch hợp. Khi kết thỳc chu kỳ nuụi cấy, thu hoạch tế bào. Xỏc định khối lượng tế bào, tỷ lệ tăng trưởng và hàm lượng paclitaxel trong tế bào và ngoài mụi trường.
2.2.1.6. Thu hoạch sinh khối thụng đỏ
Thu hoạch hỗn hợp gồm tế bào và mụi trường, lọc qua giấy lọc, thu lấy sinh khối. Sinh khối được rửa sạch với nước cất. Sau đú, sinh khối được sấy khụ tới khối lượng khụng đổi [7]. Xỏc định hàm lượng paclitaxel và cỏc chất kớch thớch sinh trưởng tồn dư (NAA và BAP) trong cỏc mẫu bằng HPLC [4], [88], [129], đúng tỳi bảo quản.