1.3.2.2. Lựa chọn cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao
Dũng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quỏ trỡnh sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp cỏc chất chuyển húa thứ cấp. Đặc biệt, khi nuụi cấy trong mụi trường lỏng, cỏc tế bào cú sự thay đổi đỏng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuụi cấy cỏc dũng tế bào khỏc nhau. Điều này là do cú sự khỏc biệt về gen dẫn đến sự khỏc biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất. Vỡ vậy, trong quỏ trỡnh nghiờn cứu phải tạo ra được những dũng tế bào phỏt triển nhanh cú khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao. Bunakova và cs [30] khi nghiờn cứu nuụi cấy 9 dũng dũng tế bào T. baccata khỏc nhau thỡ chỉ cú một dũng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 àg/g khối lượng khụ). Trong một nghiờn cứu khỏc của cựng một nhúm, dũng tế bào được Brunakova lựa chọn và nhõn bản vụ tớnh sau 20 thỏng kớch hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt tới 0,0109% [31].
1.3.2.3. Tối ưu húa mụi trường nuụi cấy
Thành phần mụi trường nuụi cấy là yếu tố tỏc động và ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất. Trong nuụi cấy cỏc loại thụng đỏ, 2 mụi trường thường được sử dụng là SH và B5. Tuy nhiờn, cỏc thành phần thường được thay đổi để tốc độ phỏt triển của tế bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất. Cỏc thành phần này thường là:
* Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon khụng chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phỏt triển của tế bào, mà cũn ảnh hưởng đến cỏc con đường sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển húa thứ cấp. Bởi hydratcarbon trong mụi trường tạo ra ỏp suất thẩm thấu. Khi ỏp suất thẩm thấu tăng, tỏc động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp cỏc phytoalexin, những chất này sẽ kớch thớch sản xuất cỏc sản phẩm thứ cấp [72], [97], [60].
* Cỏc hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc chất kớch thớch sinh trưởng là chất rất cần thiết đối với sự phỏt triển cũng như biệt húa của cỏc dũng tế bào, đặc biệt là khi tế
bào đó tỏch ra khỏi cơ thể ban đầu. Trong nuụi cấy sinh khối tế bào thụng đỏ, thường sử dụng 2 nhúm chất kớch thớch sinh trưởng chớnh là auxin (NAA; 2,4- D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP). Thụng thường, 2 nhúm chất này được sử dụng kết hợp với nhau. Cỏc hormon thực vật được sử dụng với nồng độ cao ở giai đoạn pha phỏt triển với mục đớch tăng sinh tế bào. Tuy nhiờn, khi chuyển sang mụi trường nuụi cấy để sản xuất hoạt chất, thỡ hàm lượng cỏc hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72].
* Cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)
Chất kớch thớch tăng hoạt chất đó được sử dụng như một chất quan trọng trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và cỏc dẫn chất trong nuụi cấy tế bào của cỏc loài thụng đỏ. Một số loại elicitor đó được sử dụng như: dịch chiết tế bào của cỏc loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate; lichenan; cỏc polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, cỏc acid ferulic, arachidonic và benzoic; cỏc elicitor vụ sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+ [119]. Trong đú, acid jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat) đó được chứng minh là một chất đúng vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh dẫn truyền cỏc tớn hiệu điều chỉnh gen tham gia vào quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất [102]. Vỡ vậy, cỏc chất này đó được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất. Y. Yukimune và cs [144] thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 14 của chu kỳ nuụi cấy tế bào T. baccata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lờn 48,3 mg/l và baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lờn 53,6 mg/l so với nhúm chứng. Nghiờn cứu của Wang [135] ở loài T. chinensis cho thấy, khi thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 7, thỡ sau 14 ngày nuụi cấy, tất cả cỏc hoạt chất đều tăng hơn so với nhúm khụng dựng MJ (paclitaxel tăng từ 412 àg/g lờn 3,153 àg/g, bacatin III từ 7 àg/g lờn 69 àg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 àg/g lờn 456 àg/g).
* Tiền chất (precursor)
Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng cỏc tiền chất trong quỏ trỡnh nuụi cấy, giỳp làm giảm thời gian sinh tổng hợp cỏc hoạt chất.
Tuy nhiờn, việc bổ sung tiền chất phải dựa trờn hiểu biết về con đường sinh tổng hợp của hoạt chất đú. Với paclitaxel, quỏ trỡnh sinh tổng hợp bắt đầu từ cỏc phõn tử isopentenyl diphosphat trải qua nhiều phản ứng trung gian để tạo ra khung cơ bản taxan (10-deacetyl baccatin III, baccatin III) trước khi phản ứng với phenylalanin dạng Coenzyme A để tạo ra cấu trỳc cơ bản của paclitaxel (hỡnh 1.5) [125]. Vỡ vậy, cỏc nhà khoa học đó bổ sung tiền chất phenylalanin vào mụi trường nuụi cấy, nhằm tăng nhanh việc hỡnh thành sản phẩm paclitaxel. Khi nuụi cấy loài T. baccata, người ta đó bổ sung phenylalanin kết hợp với sử dụng AgNO3, VSO4, CoCl2 để kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất. Kết quả, hàm lượng paclitaxel cao hơn gấp 5-6 lần (13,75 mg/l) so với nhúm chứng (2,5 mg/l) [72].
1.3.2.4. Tối ưu húa điều kiện nuụi cấy
Trong việc tối ưu húa điều kiện nuụi cấy, thường sử dụng cỏc chiến lược nhằm tăng sinh hoạt chất cho tế bào. Cỏc chiến lược đú bao gồm:
* Nuụi cấy 2 giai đoạn(two stage culture system)
Quỏ trỡnh phỏt triển của tế bào trải qua 4 giai đoạn khỏc nhau: giai đoạn thớch nghi, giai đoạn phỏt triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn. Trong đú, giai đoạn phỏt triển là giai đoạn tế bào tăng sinh nhanh, tạo ra khối lượng lớn tế bào; cũn giai đoạn ổn định diễn ra quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất. Vỡ vậy, hiện nay người ta đó sử dụng hệ thống nuụi cấy 2 giai đoạn, với 2 mụi trường khỏc nhau cho giai đoạn phỏt triển và giai đoạn ổn định. Trước hết, cần tạo được mụi trường thuận lợi ở giai đoạn phỏt triển, để tế bào phỏt triển tốt nhất, thu được khối lượng tế bào cao nhất. Khi tế bào chuyển sang giai đoạn ổn định, sẽ chuyển sang mụi trường mới, giỳp duy trỡ và kộo dài giai đoạn ổn định, nhằm làm cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất được kộo dài hơn. Ngoài ra, trong giai đoạn này cú thể bổ sung cỏc tiền chất và cỏc elicitor gúp phần kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất ở mức cao nhất. Chiến lược này đó được sử dụng thành cụng để cải thiện việc sản xuất paclitaxel và baccatin III khi nuụi cấy cỏc loài thụng đỏ trong mụi trường lỏng. Khi nuụi
cấy dũng tế bào T. baccata, J. Palazon và cs [108] đó sử dụng mụi trường B5 cú bổ sung saccharose (0,5%), fructose (0,5%), NAA (2,0 mg/l), BAP (0,1 mg/l) giỳp tăng trưởng, sau đú chuyển giao mụi trường saccharose 3%, picloram 2,0 mg/l và kinetin 0,1 mg/l, để tạo thành paclitaxel và baccatin III. Kết quả, hàm lượng paclitaxel đạt 1,58 mg/l, baccatin III đạt 0,32 mg/l, cao hơn so với khi sử dụng một loại mụi trường.
* Nuụi cấy 2 pha (two phase culture):
Nuụi cấy 2 pha là sử dụng thờm pha khụng tan trong mụi trường nuụi cấy, nhằm hấp phụ cỏc chất chuyển húa sinh ra trong quỏ trỡnh nuụi cấy, mà cỏc chất này thụng thường cú tỏc dụng ức chế ngược quỏ trỡnh sinh trưởng cũng như tổng hợp hoạt chất. Hệ thống nuụi cấy 2 pha đó ứng dụng thành cụng trong sản xuất sinh khối tế bào thụng đỏ. Trong đú, pha thứ 2 cú thể dựng là chất rắn hấp phụ hoặc dung mụi khụng đồng tan với mụi trường. Tuy nhiờn, cỏc chất rắn cú nhiều ưu điểm hơn và hay được sử dụng hơn. Kwon và cs [80] đó bổ sung Amberlite XAD khụng ion (một dạng polymer khụng tan trong nước) vào ngày thứ 16 trong chu kỳ nuụi cấy tế bào T. cuspidata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel thu được tăng lờn 40-70%. Ngoài sử dụng chất rắn hấp phụ, người ta cũn sử dụng chất lỏng hữu cơ như dibutyl phthalat, glycerol, dầu silicon, ether, parafin,… Tuy nhiờn, việc bổ sung cỏc chất lỏng hữu cơ cú thể gõy độc và làm chết tế bào. Vỡ vậy, cần phải nghiờn cứu đầy đủ về độc tớnh, cỏch sử dụng để thu được hiệu quả tốt nhất.
* Bất động tế bào (Immobilization)
Bất động tế bào là quỏ trỡnh làm giảm sự chuyển động của tế bào trong mụi trường nuụi cấy. Khi bất động tế bào sẽ làm mật độ tế bào cao hơn, khả năng tiếp xỳc tế bào – tế bào tăng, bảo vệ được tế bào dưới chuyển động của dũng mụi trường khi khuấy trộn và ngăn ngừa rửa trụi tế bào trong khi vận hành liờn tục. Với những ưu điểm này, bất động tế bào đó làm tăng quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất, tế bào phỏt triển tốt hơn [29]. Để tạo ra sự bất động tế bào, người ta sử dụng cỏc chất tạo gel khỏc nhau như alginat, carrageenan,
polyacrylamid, agarose, polyurethan,… Trong nuụi cấy tế bào T. baccata, Bentebibel và cs [23] đó sử dụng calci alginat để làm bất động cỏc tế bào trong sản xuất paclitaxel và baccatin III. Kết quả cho thấy, sự bất động tế bào đó nõng cao hàm lượng hoạt chất từ 2-3 lần so với nuụi cấy tế bào khụng làm bất động. Tuy nhiờn, quỏ trỡnh này cũn phụ thuộc vào loại chất cũng như nồng độ chất tạo gel cho vào mụi trường nuụi cấy. Khi sử dụng alginat ở cỏc nồng độ 1,5%, 2% và 2,5% thỡ hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt là 13,20 mg/l, 10,85 mg/l và 11,90 mg/l; cũn hàm lượng baccatin III đạt tối đa 4,62 mg/l khi sử dụng alginat 2,5%.
Ngoài ra, trong quỏ trỡnh nuụi cấy tế bào cũn phải khảo sỏt ảnh hưởng của cỏc yếu tố khỏc như nhiệt độ nuụi cấy, nồng độ khớ hũa tan, thời gian một chu kỳ nuụi cấy, pH mụi trường nuụi cấy cũng như cỏc biện phỏp kớch hoạt gen để tăng sinh tổng hợp hoạt chất.
1.3.3. Phương phỏp định lượng paclitaxel và cỏc dẫn chất sử dụng trong
đỏnh giỏ chất lượng sinh khối tế bào thụng đỏ
Để đỏnh giỏ chất lượng của sinh khối tế bào thụng đỏ cũng hiệu quả của cỏc khảo sỏt lựa chọn quy trỡnh sinh khối tế bào thụng đỏ (Taxus sp.), cần phải xõy dựng cỏc phương phỏp định lượng cỏc hoạt chất chớnh trong sinh khối tế bào thụng đỏ như paclitaxel, baccatin III, 10-DAP, cephalomanin… Hiện nay phương phỏp phõn tớch đồng thời cỏc hoạt chất trong thụng đỏ thường sử dụng HPLC. Trong đú, đỏng chỳ ý phải sử dụng cột chuyờn dụng cho phõn tớch thụng đỏ như: Curosil - PFP (250ì4,6 mm; 5 àm); Kromasil C18 (250ì4,6 mm; 5 àm); Phenyl Dynamax 60A0 (250ì4,6 mm; 8 àm); Cột Luna L43 (250 x 4,6 mm; 5 àm)…[14], [81]. Ngoài ra, dectector PDA cũng thường được sử dụng nhằm tăng giới hạn phỏt hiện, đồng hợp hạn chế cỏc nhầm lẫn cho chồng pớc. Trong nghiờn cứu phải xõy dựng phương phỏp định lượng cỏc hoạt chất trong sinh khối thụng đỏ để tỡm ra cỏc điều kiện thớch hợp cho từng loại mẫu cụ thể như: cỏch thức xử lý mẫu, điều kiện pha động, cột. Ngoài ra, phương phỏp phải được thẩm định độ chớnh xỏc, độ đỳng, độ ổn
định… Trong nuụi cấy loài thụng đỏ Trung Quốc, Yan [138] đó sử dụng cột Kromasil C18 (250ì4,6 mm; 5 àm), detector PDA mảng diod, với hệ pha động CH3OH-H2O (65:35, tt/tt) để định lượng paclitaxel, baccatin III và cephalomanlin trong sinh khối. Một số nghiờn cứu khỏc sử dụng cột chiết pha rắn để loại tạp chất trong mẫu trước khi định lượng [25]. Pha động hay sử dụng để định lượng paclitaxel và cỏc dẫn chất taxan thường là hỗn hợp MeOH, ACN và nước cất với chế độ gradient [54].
1.3.4. Cỏc phương phỏp chiết xuất phõn lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ thụng đỏ
Việc chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thụng đỏ thường gặp nhiều khú khăn do trong thành phần húa học cú chứa nhiều chất cú cấu trỳc húa học gần giống nhau. Vỡ vậy, để tinh chế đạt tiờu chuẩn dược dụng (>97%) phải sử dụng cỏc phương phỏp tinh chế đắt tiền như: sắc ký cột, sắc ký điều chế, do đú tốn thời gian cũng như dung mụi húa chất và hiệu suất thu được thấp [75]. Cho đến nay đó cú nhiều tỏc giả đó nghiờn cứu đưa ra cỏc phương phỏp đơn giản, ớt tốn kộm hơn để tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào [43], [62], [66], [113]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thụng thường paclitaxel được chiết xuất trong sinh khối bằng cỏc dung mụi hữu cơ như: methanol, hexan, cloroform, aceton… trong đú methanol tỏ ra là dung mụi cú hiệu quả nhất (hiệu suất >95%, hàm lượng paclitaxel đạt 0,5%). Sau khi thu được dịch chiết thụ tiến hành giai đoạn tinh chế sơ bộ bằng nhiều phương phỏp khỏc nhau, trong đú cú xử lý hấp phụ bằng than hoạt tớnh, đất sột hoạt tớnh. Đặc biệt, nghiờn cứu tinh chế dựa vào nguyờn lý kết tinh phõn đoạn và kết tủa dựa vào sự thay đổi độ tan của paclitaxel trong cỏc dung mụi khỏc nhau. Cỏc tỏc giả đó đề ra được phương phỏp tinh chế mới đơn giản hơn và độ tinh khiết thu được của sản phẩm đó được cải thiện đỏng kể. Kim và cs [75] nghiờn cứu về phương phỏp tinh chế paclitaxel từ sinh khối, bằng cỏch xử lý dịch chiết xuất với cỏc chất hấp phụ khỏc nhau và sử dụng 2 hỗn hợp dung mụi ở 2 giai đoạn kết tủa khỏc nhau. Kết quả đó lựa chọn được chất
hấp phụ tối ưu là đất sột hoạt tớnh với tỷ lệ là 50% (kl/kl) ở nhiệt độ 400C, lựa chọn được hỗn hợp dung mụi DCM : n-hexan cho giai đoạn kết tủa 1 với hiệu suất thu được >95% và độ tinh khiết của sản phẩm >25%. Ở kết tủa giai đoạn 2 hỗn hợp dung mụi MeOH : H2O cho sản phẩm cú độ tinh khiết >65% và hiệu suất là >85%. Ngoài ra nhiều tỏc giả cũng nghiờn cứu cỏc điều kiện ảnh hưởng tới quỏ trỡnh tinh chế bằng hỗn hợp dung mụi, kết tinh phõn đoạn như: nhiệt độ kết tinh, thời gian kết tinh, pH dung mụi, điều kiện khuấy trộn… [43], [62], [63], [66].
Một phương phỏp khỏc trong nghiờn cứu tinh chế paclitaxel là sử dụng chất tạo mixen gắn hoạt chất vào phần giữa của cấu trỳc mixen, sau đú chiết paclitaxel ra khỏi mixen bằng dung mụi hữu cơ và thực hiện tiếp giai đoạn kết tủa bằng hỗn hợp dung mụi. Kim và cs [74] đó sử dụng phương phỏp tinh chế ban đầu paclitaxel bằng tạo ra mixen sau đú tiếp tục tinh chế bằng kết tủa phõn đoạn. Kết quả nghiờn cho thấy chiết paclitaxel từ sinh khối bằng dung mụi MeOH, sau 4 lần cho hiệu suất là 99%. Khi chuyển dịch chiết paclitaxel thụ vào chất lỏng N-cetylpyridin chlorid (chất tạo mixen), sau đú chiết với MtBE (methyl t-butyl ether), dịch chiết sẽ được kết tủa với hexan thỡ hiệu suất thu được là 80% với độ tinh khiết của paclitaxel đạt 65,8%.
Như vậy cú thể thấy rằng quỏ trỡnh chiết xuất phõn lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ đó được nghiờn cứu rất nhiều, trong đú đặc biệt chỳ ý đến cỏc điều kiện của giai đoạn tinh chế nhằm làm tăng độ tinh khiết của sản phẩm trước khi sử dụng cỏc biện phỏp tinh chế đặc biệt khỏc như HPLC, sắc ký cột... để thu được paclitaxel đạt tiờu chuẩn dược dụng.
CHƯƠNG 2
NGUYấN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. NGUYấN LIỆU, HểA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIấN CỨU 2.1.1. Nguyờn liệu và hoỏ chất
- Mẫu cành non cõy thụng đỏ 10 tuổi (Taxus wallichiana Zucc.) thu thập tại Đà Lạt, Lõm Đồng vào thỏng 4 năm 2008. Được Viện Sinh thỏi tài nguyờn sinh vật -Viện khoa học cụng nghệ VN thẩm định (xem phụ lục 1).
- Cỏc húa chất dựng để pha chế mụi trường nuụi cấy của hóng Sigma đạt tiờu chuẩn cho nuụi cấy tế bào thực vật. Cỏc chất chuẩn paclitaxel (99,98%), baccatin III (99,78%), acid 1-naphtalen acetic (99,95%), 6-benzyl amino purin (99,81%) của Sigma.
- Cỏc hoỏ chất dựng trong chiết xuất, phõn lập, phõn tớch kiểm nghiệm của Merck.
2.1.2. Thiết bị nghiờn cứu
- Hệ thống phũng thớ nghiệm đạt tiờu chuẩn vụ khuẩn dựng cho nuụi cấy tế bào của Học viện Quõn y.
- Tủ nuụi cấy vi sinh, model LHC – 4A1 (hóng Esco – Singapo). - Hệ thống mỏy lắc, model: ISF-4-W (Hóng Kuhner – Thụy Sĩ). - Tủ tạo khụng khớ sạch -Lamine (Narie – Đức).
- Mỏy hấp tiệt trựng Hirayama – model HV-110 (Nhật).
- Mỏy sắc ký lỏng hịờu năng cao detector PDA - UV 2 kờnh