Hiện nay cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật đó ỏp dụng trong nghiờn cứu và sản xuất paclitaxel từ cỏc loài thụng đỏ. Trong nhiều thập kỉ qua, cỏc nghiờn cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và cỏc dẫn chất bằng việc nuụi cấy tế bào cỏc loài thụng đỏ đó được tiến hành như T. brevifolia, T. baccata, T. cuspidata, T. chinensis, T. canadensis, T. yunnanensis, T. x media. Trong đú điển hỡnh là cỏc nghiờn cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như cỏc biện phỏp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu húa điều kiện nuụi cấy, sàng lọc cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao, tối ưu húa mụi trường nuụi cấy, cỏc biện phỏp kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất như sử dụng cỏc chất kớch thớch sinh hoạt chất và cỏc tiền chất, cũng như kỹ thuật nuụi hai pha, nuụi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế bào [119], [125].
1.3.2.1. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel
Paclitaxel được hỡnh thành chủ yếu từ nguyờn liệu ban đầu là cỏc phõn tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hỡnh 1.5).
Việc nghiờn cứu tỡm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thụng đỏ, gúp phần cung cấp cỏc hiểu biết về phản ứng cũng như cỏc enzyme tham gia phản ứng. Từ đú giỳp cỏc nhà khoa học nghiờn cứu cỏc biện phỏp kớch
hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine, sử dụng elicitor, cỏc chất kớch hoạt enzym [41], [125].
Hỡnh 1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel
1.3.2.2. Lựa chọn cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao
Dũng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quỏ trỡnh sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp cỏc chất chuyển húa thứ cấp. Đặc biệt, khi nuụi cấy trong mụi trường lỏng, cỏc tế bào cú sự thay đổi đỏng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuụi cấy cỏc dũng tế bào khỏc nhau. Điều này là do cú sự khỏc biệt về gen dẫn đến sự khỏc biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất. Vỡ vậy, trong quỏ trỡnh nghiờn cứu phải tạo ra được những dũng tế bào phỏt triển nhanh cú khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao. Bunakova và cs [30] khi nghiờn cứu nuụi cấy 9 dũng dũng tế bào T. baccata khỏc nhau thỡ chỉ cú một dũng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 àg/g khối lượng khụ). Trong một nghiờn cứu khỏc của cựng một nhúm, dũng tế bào được Brunakova lựa chọn và nhõn bản vụ tớnh sau 20 thỏng kớch hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt tới 0,0109% [31].
1.3.2.3. Tối ưu húa mụi trường nuụi cấy
Thành phần mụi trường nuụi cấy là yếu tố tỏc động và ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất. Trong nuụi cấy cỏc loại thụng đỏ, 2 mụi trường thường được sử dụng là SH và B5. Tuy nhiờn, cỏc thành phần thường được thay đổi để tốc độ phỏt triển của tế bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất. Cỏc thành phần này thường là:
* Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon khụng chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phỏt triển của tế bào, mà cũn ảnh hưởng đến cỏc con đường sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển húa thứ cấp. Bởi hydratcarbon trong mụi trường tạo ra ỏp suất thẩm thấu. Khi ỏp suất thẩm thấu tăng, tỏc động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp cỏc phytoalexin, những chất này sẽ kớch thớch sản xuất cỏc sản phẩm thứ cấp [72], [97], [60].
* Cỏc hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc chất kớch thớch sinh trưởng là chất rất cần thiết đối với sự phỏt triển cũng như biệt húa của cỏc dũng tế bào, đặc biệt là khi tế
bào đó tỏch ra khỏi cơ thể ban đầu. Trong nuụi cấy sinh khối tế bào thụng đỏ, thường sử dụng 2 nhúm chất kớch thớch sinh trưởng chớnh là auxin (NAA; 2,4- D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP). Thụng thường, 2 nhúm chất này được sử dụng kết hợp với nhau. Cỏc hormon thực vật được sử dụng với nồng độ cao ở giai đoạn pha phỏt triển với mục đớch tăng sinh tế bào. Tuy nhiờn, khi chuyển sang mụi trường nuụi cấy để sản xuất hoạt chất, thỡ hàm lượng cỏc hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72].
* Cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)
Chất kớch thớch tăng hoạt chất đó được sử dụng như một chất quan trọng trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và cỏc dẫn chất trong nuụi cấy tế bào của cỏc loài thụng đỏ. Một số loại elicitor đó được sử dụng như: dịch chiết tế bào của cỏc loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate; lichenan; cỏc polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, cỏc acid ferulic, arachidonic và benzoic; cỏc elicitor vụ sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+ [119]. Trong đú, acid jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat) đó được chứng minh là một chất đúng vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh dẫn truyền cỏc tớn hiệu điều chỉnh gen tham gia vào quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất [102]. Vỡ vậy, cỏc chất này đó được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất. Y. Yukimune và cs [144] thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 14 của chu kỳ nuụi cấy tế bào T. baccata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lờn 48,3 mg/l và baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lờn 53,6 mg/l so với nhúm chứng. Nghiờn cứu của Wang [135] ở loài T. chinensis cho thấy, khi thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 7, thỡ sau 14 ngày nuụi cấy, tất cả cỏc hoạt chất đều tăng hơn so với nhúm khụng dựng MJ (paclitaxel tăng từ 412 àg/g lờn 3,153 àg/g, bacatin III từ 7 àg/g lờn 69 àg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 àg/g lờn 456 àg/g).
* Tiền chất (precursor)
Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng cỏc tiền chất trong quỏ trỡnh nuụi cấy, giỳp làm giảm thời gian sinh tổng hợp cỏc hoạt chất.
Tuy nhiờn, việc bổ sung tiền chất phải dựa trờn hiểu biết về con đường sinh tổng hợp của hoạt chất đú. Với paclitaxel, quỏ trỡnh sinh tổng hợp bắt đầu từ cỏc phõn tử isopentenyl diphosphat trải qua nhiều phản ứng trung gian để tạo ra khung cơ bản taxan (10-deacetyl baccatin III, baccatin III) trước khi phản ứng với phenylalanin dạng Coenzyme A để tạo ra cấu trỳc cơ bản của paclitaxel (hỡnh 1.5) [125]. Vỡ vậy, cỏc nhà khoa học đó bổ sung tiền chất phenylalanin vào mụi trường nuụi cấy, nhằm tăng nhanh việc hỡnh thành sản phẩm paclitaxel. Khi nuụi cấy loài T. baccata, người ta đó bổ sung phenylalanin kết hợp với sử dụng AgNO3, VSO4, CoCl2 để kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất. Kết quả, hàm lượng paclitaxel cao hơn gấp 5-6 lần (13,75 mg/l) so với nhúm chứng (2,5 mg/l) [72].
1.3.2.4. Tối ưu húa điều kiện nuụi cấy
Trong việc tối ưu húa điều kiện nuụi cấy, thường sử dụng cỏc chiến lược nhằm tăng sinh hoạt chất cho tế bào. Cỏc chiến lược đú bao gồm:
* Nuụi cấy 2 giai đoạn(two stage culture system)
Quỏ trỡnh phỏt triển của tế bào trải qua 4 giai đoạn khỏc nhau: giai đoạn thớch nghi, giai đoạn phỏt triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn. Trong đú, giai đoạn phỏt triển là giai đoạn tế bào tăng sinh nhanh, tạo ra khối lượng lớn tế bào; cũn giai đoạn ổn định diễn ra quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất. Vỡ vậy, hiện nay người ta đó sử dụng hệ thống nuụi cấy 2 giai đoạn, với 2 mụi trường khỏc nhau cho giai đoạn phỏt triển và giai đoạn ổn định. Trước hết, cần tạo được mụi trường thuận lợi ở giai đoạn phỏt triển, để tế bào phỏt triển tốt nhất, thu được khối lượng tế bào cao nhất. Khi tế bào chuyển sang giai đoạn ổn định, sẽ chuyển sang mụi trường mới, giỳp duy trỡ và kộo dài giai đoạn ổn định, nhằm làm cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất được kộo dài hơn. Ngoài ra, trong giai đoạn này cú thể bổ sung cỏc tiền chất và cỏc elicitor gúp phần kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất ở mức cao nhất. Chiến lược này đó được sử dụng thành cụng để cải thiện việc sản xuất paclitaxel và baccatin III khi nuụi cấy cỏc loài thụng đỏ trong mụi trường lỏng. Khi nuụi
cấy dũng tế bào T. baccata, J. Palazon và cs [108] đó sử dụng mụi trường B5 cú bổ sung saccharose (0,5%), fructose (0,5%), NAA (2,0 mg/l), BAP (0,1 mg/l) giỳp tăng trưởng, sau đú chuyển giao mụi trường saccharose 3%, picloram 2,0 mg/l và kinetin 0,1 mg/l, để tạo thành paclitaxel và baccatin III. Kết quả, hàm lượng paclitaxel đạt 1,58 mg/l, baccatin III đạt 0,32 mg/l, cao hơn so với khi sử dụng một loại mụi trường.
* Nuụi cấy 2 pha (two phase culture):
Nuụi cấy 2 pha là sử dụng thờm pha khụng tan trong mụi trường nuụi cấy, nhằm hấp phụ cỏc chất chuyển húa sinh ra trong quỏ trỡnh nuụi cấy, mà cỏc chất này thụng thường cú tỏc dụng ức chế ngược quỏ trỡnh sinh trưởng cũng như tổng hợp hoạt chất. Hệ thống nuụi cấy 2 pha đó ứng dụng thành cụng trong sản xuất sinh khối tế bào thụng đỏ. Trong đú, pha thứ 2 cú thể dựng là chất rắn hấp phụ hoặc dung mụi khụng đồng tan với mụi trường. Tuy nhiờn, cỏc chất rắn cú nhiều ưu điểm hơn và hay được sử dụng hơn. Kwon và cs [80] đó bổ sung Amberlite XAD khụng ion (một dạng polymer khụng tan trong nước) vào ngày thứ 16 trong chu kỳ nuụi cấy tế bào T. cuspidata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel thu được tăng lờn 40-70%. Ngoài sử dụng chất rắn hấp phụ, người ta cũn sử dụng chất lỏng hữu cơ như dibutyl phthalat, glycerol, dầu silicon, ether, parafin,… Tuy nhiờn, việc bổ sung cỏc chất lỏng hữu cơ cú thể gõy độc và làm chết tế bào. Vỡ vậy, cần phải nghiờn cứu đầy đủ về độc tớnh, cỏch sử dụng để thu được hiệu quả tốt nhất.
* Bất động tế bào (Immobilization)
Bất động tế bào là quỏ trỡnh làm giảm sự chuyển động của tế bào trong mụi trường nuụi cấy. Khi bất động tế bào sẽ làm mật độ tế bào cao hơn, khả năng tiếp xỳc tế bào – tế bào tăng, bảo vệ được tế bào dưới chuyển động của dũng mụi trường khi khuấy trộn và ngăn ngừa rửa trụi tế bào trong khi vận hành liờn tục. Với những ưu điểm này, bất động tế bào đó làm tăng quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất, tế bào phỏt triển tốt hơn [29]. Để tạo ra sự bất động tế bào, người ta sử dụng cỏc chất tạo gel khỏc nhau như alginat, carrageenan,
polyacrylamid, agarose, polyurethan,… Trong nuụi cấy tế bào T. baccata, Bentebibel và cs [23] đó sử dụng calci alginat để làm bất động cỏc tế bào trong sản xuất paclitaxel và baccatin III. Kết quả cho thấy, sự bất động tế bào đó nõng cao hàm lượng hoạt chất từ 2-3 lần so với nuụi cấy tế bào khụng làm bất động. Tuy nhiờn, quỏ trỡnh này cũn phụ thuộc vào loại chất cũng như nồng độ chất tạo gel cho vào mụi trường nuụi cấy. Khi sử dụng alginat ở cỏc nồng độ 1,5%, 2% và 2,5% thỡ hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt là 13,20 mg/l, 10,85 mg/l và 11,90 mg/l; cũn hàm lượng baccatin III đạt tối đa 4,62 mg/l khi sử dụng alginat 2,5%.
Ngoài ra, trong quỏ trỡnh nuụi cấy tế bào cũn phải khảo sỏt ảnh hưởng của cỏc yếu tố khỏc như nhiệt độ nuụi cấy, nồng độ khớ hũa tan, thời gian một chu kỳ nuụi cấy, pH mụi trường nuụi cấy cũng như cỏc biện phỏp kớch hoạt gen để tăng sinh tổng hợp hoạt chất.