Mẻ nuụi cấy Ttrỷ lưởệ sinh ng (lần) Hàm lượng paclitaxel trong tế bào (mg/l) Hàm lượng paclitaxel ngoài mụi trường (mg/l) 1 3,37 12,16 1,28 2 3,55 12,89 1,46 3 3,73 13,56 1,13 4 3,41 13,99 1,16 5 3,67 13,96 1,25 6 3,91 13,87 1,37 7 3,61 10,04 1,12 8 3,53 12,88 1,09 TB 3,60 12,92 1,23 SD 0,16 1,33 0,13
Kết quả ở bảng 3.27 cho thấy: với cỏc điều kiện đó khảo sỏt trong giai đoạn nuụi cấy trờn bỡnh lắc khi chuyển sang nuụi cấy trong hệ thống bioreactor 5 lớt, sau 17 ngày nuụi cấy tốc độ phỏt triển đạt 3,60 lần, hàm lượng paclitaxel đạt 12,92 mg/l. Hàm lượng paclitaxel ly giải ra ngoài mụi trường là 1,23 mg/l. Như vậy, so với nuụi cấy trong bỡnh lắc thỡ tốc độ phỏt triển của tế bào giảm hơn. Hàm lượng hoạt chất trong tế bào cũng thấp hơn.
3.1.5. Kết quả nghiờn cứu thu hoạch sinh khối tế bào thụng đỏ
Sơ đồ quy trỡnh thu hoạch sinh khối tế bào thụng đỏ được mụ tả trong hỡnh 3.8.
Mụ tả quy trỡnh:
- Rỳt hỗn dịch sinh khối tế bào thụng đỏ ra khỏi bỡnh nuụi cấy và để lắng tự nhiờn 1 giờ.
- Hỗn dịch nuụi cấy được lọc bằng mỏy hỳt chõn khụng để thu lấy khối tế bào.
- Khối tế bào được hoà vào trong nước cất theo tỷ lệ 5 phần nước: 1 phần sinh khối tế bào, sau đú lọc loại bỏ phần nước rửa. Phần tế bào tiếp tục
được rửa thờm 2 lần nữa, thu được sinh khối thụng đỏ là dạng bột màu nõu đậm và xốp.
- Bột sinh khối thụng đỏ được sấy khụ trong tủ sấy cú quạt giú ở nhiệt độ 600C cho tới khối lượng khụng đổi.
- Kiểm nghiệm sản phẩm, đúng tỳi PE 02 lần, bảo quản nơi khụ mỏt.
Hỡnh 3.8. Sơđồ quy trỡnh thu hoạch sinh khối tế bào thụng đỏ trong
Bioreactor
* Kết quả thu hoạch 8 mẻ nuụi cấy tế bào thụng đỏ trờn hệ thống bỡnh nuụi cấy 5 lớt và xỏc định dư lượng NAA, BAP trong sinh khối, cũng như hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được trỡnh bày trong bảng 3.28.
* Định lượng NAA trong sinh khối tế bào: Cõn chớnh xỏc khoảng 1 g bột SKTB thụng đỏ khụ, thờm 20 ml nước và 4 ml NaOH 50%. Đun hồi lưu trong 3 giờ. Ly tõm, lấy phần dịch trong. Thờm 10 ml DCM, lắc trong 1 phỳt. Chờ phõn lớp, lấy phần dịch nổi ở trờn. Acid hoỏ bằng khoảng 3 – 4 ml HCl đặc tới pH <2. Để nguội, chiết bằng 20 ml DCM x 2 lần. Dịch chiết DCM được làm khan bằng natri sulfat khan. Gộp dịch chiết DCM và đuổi dung mụi bằng dũng nitơ nhẹ ở nhiệt độ 350C tới cắn. Thờm chớnh xỏc 10 ml DCM, lắc kỹ trong 1 phỳt. Lọc qua
Lọc qua giấy lọc Kiểm nghiệm Sấy 600C /10 giờ Rửa 3 lần bằng nước cất Hỗn dịch nuụi cấy Khối tế bào thụ Khối tế bào sạch Khối tế bào khụ Sản phẩm Mụi trường thừa Nước rửa
2 g natri sulfat khan. Bỏ khoảng 2 ml dịch lọc đầu. Hỳt chớnh xỏc 1 ml dịch lọc chuyển vào cột chiết pha rắn (silica gel 2g) để loại tạp. Rửa giải với 5 ml hỗn hợp 99%DCM 1% acid acetic x 3 lần. Lấy toàn bộ dịch rửa giải để đuổi dung mụi hữu cơ bằng dũng khớ nitơ tới cắn. Thờm chớnh xỏc 10 ml ACN 50% trong nước, lắc kỹ, lọc qua màng lọc 0,45 àm. Tiến hành sắc ký với điều kiện: cột SAX; 400C; pha động: MeCN: 0,025M KH2PO4 pH 5 (30:70, tt/tt); tốc độ dũng: 0,8 ml/phỳt; thể tớch tiờm mẫu: 20 àl; nhiệt độ buồng bơm mẫu 40C; detector huỳnh quang bước súng 220 và 340 nm [4], [129].
* Định lượng BAP: Cõn chớnh xỏc khoảng 1 g SKTB thụng đỏ khụ chiết hồi lưu bằng Soxhlet với 100 ml EtOH 95% trong 3 giờ. Dịch chiết EtOH được bốc hơi trong chõn khụng tới cắn. Hũa tan cắn trong 8 ml đệm amoni formiat (0,01M, pH =3,7), sau đú loại tạp bằng cỏch chiết với ether ethylic 3 lần. Dung dịch đệm sau khi loại tạp được điều chỉnh về pH=5,6 với dung dịch NH4OH 5%. Loại tạp bằng cột chiết pha rắn rửa lần lượt với nước khử ion, dung dịch HCl 0,5N, dung dịch NaOH 0,5N. Rửa giải bằng 50 ml MeOH. Dịch rửa giải được đuổi dung mụi hữu cơ bằng dũng khớ nitơ tới cắn. Hũa tan cắn trong 1ml MeOH để phõn tớch bằng HPLC. Tiến hành sắc ký với điều kiện: Cột C8; pha động: Nước : methanol (30 : 70 tt/tt), tốc độ dũng: 1,0 ml/phỳt; thể tớch tiờm mẫu: 6 àl. Detector PDA 255 nm [88].
Bảng 3.28. Kết quả phõn tớch dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel
trong cỏc mẻ nuụi cấy sinh khối thụng đỏ
Mẻ cấy (ppm) NAA (ppm) BAP Hàm lượ%(kl/kl) ng paclitaxel
Mẻ 1 1,22 0,51 0,0361 Mẻ 2 1,91 0,64 0,0354 Mẻ 3 1,20 0,57 0,0362 Mẻ 4 1,92 0,66 0,0368 Mẻ 5 1,89 0,71 0,0352 Mẻ 6 1,78 0,59 0,0384 Mẻ 7 1,94 0,67 0,0321 Mẻ 8 1,98 0,53 0,0386 x 1,73 0,61 0,0361 SD 0,13 0,07 0,0020
Sau 8 mẻ nuụi cấy trờn hệ thống bioreactor 5 lớt thỡ hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 0,0361%. Dư lượng cỏc chất kớch thớch sinh trưởng sử dụng trong quỏ trỡnh nuụi cấy gồm NAA và BAP lần lượt là 1,73 và 0,61 ppm (khối lượng tế bào khụ).
Mẫu sinh khối tế bào thụng đỏ thu được đó kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và đạt yờu cầu cỏc chỉ tiờu chất lượng theo TCCS trong đú hàm lượng paclitaxel và baccatin III lần lượt là 0,038% và 0,0061% (số phiếu 42/TCH 01 ngày 01 thỏng 12 năm 2011 – Xem phần phụ lục).
3.1.6. Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thụng đỏ
Từ cỏc kết quả khảo sỏt thu được, đưa ra quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thụng đỏ quy mụ phũng thớ nghiệm như sau (hỡnh 3.9):
- Mẫu thõn non thụng đỏ tự nhiờn được tiệt khuẩn bằng dung dịch HgCl2 0,07% + tween 80 (0,01%) trong thời gian 17 phỳt. Mẫu được cắt thành cỏch lỏt nhỏ. Cấy mẫu vào trong mụi trường B5 cú bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 240C. Nuụi cấy khụng cú ỏnh sỏng trong 35 ngày để thu callus.
- Cấy chuyển callus 4 lần trong mụi trường thạch SH cú bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 22-240C, thời gian 35 ngày để duy trỡ callus
- Cấy chuyển tế bào (tỷ lệ 20%) sang mụi trường lỏng SH cú bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6; điều kiện nuụi cấy: nhiệt độ 240C, tốc độ mỏy lắc 130 vũng/phỳt, thời gian 14 ngày.
- Cấy chuyển tế bào sang hệ thống bioreactor 5 lớt trong mụi trường SH cú bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6; điều kiện nuụi cấy: nhiệt độ 240C, đến ngày thứ 10 thờm saccharose (20 g/l), ngày thứ 12 bổ sung methyl jasmonat (100 àM), tiếp tục nuụi đến ngày thứ17 ngày, trong điều kiện khụng cú ỏnh sỏng. Lọc lấy tế bào, rửa sạch bằng nước cất 3 lần, sấy khụ ở 600C trong 10 giờ được sản phẩm sinh khối tế bào thụng đỏ.
Hỡnh 3.9. Sơđồ quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thụng đỏ
Callus
SKTB/MT lỏng
- Môi tr−ờng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/), saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Nuôi trong điều kiện: t0= 22-240C; thời 35 ngày; không có ánh sáng. Cấy chuyển 4 lần
Duy trì nuôi cấy trong môi tr−ờng thạch
Thông đỏ tự nhiên
- Tiệt khuẩn mẫu cây bằng HgCl + Tween 80
- Cấy vào MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l), saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Điều kiện nuôi cấy: 35 ngày, nhiệt độ240C, không có ánh sáng
Tạo callus
Nuôi cấy
trên môi tr−ờng lỏng
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l).
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 130 v/phút, thời gian:14 ngày
Callus/MT thạch
Sinh khối/ Bioreactor
- Lọc lấy tế bào
- Rửa 3 lần với n−ớc cất
- Sấy khô 40 -600C/10giờ
Thu sinh khối
SKTB khô
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l+20g/l ở ngày thứ 10), thêm MJ (100àM) ngày thứ 12
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C; pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời gian:17 ngày
Nuôi cấy trong hệ thống bioreactor 5 lít
3.2. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU THÀNH PHẦN HểA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIấU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIấU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THễNG ĐỎ
3.2.1. Xỏc định thành phần húa học trong sinh khối tế bào thụng đỏ
3.2.1.1. Xõy dựng phương phỏp định tớnh và định lượng cỏc hoạt chất
trong sinh khối tế bào thụng đỏ bằng HPLC
* Kết quả xõy dựng phương phỏp xử lý mẫu
- Chiết lỏng - lỏng với hỗn hợp dung mụi methanol - dicloromethan (3:1, tt/tt), chiết nhiều lần, rồi phõn tớch ngay bằng HPLC.
- Chiết lỏng - rắn với dung mụi chiết methanol, chiết nhiều lần, sau đú tinh chế bằng cột chiết pha rắn trước khi chạy HPLC.
Kết quả sắc ký đồ của 2 phương phỏp xử lý mẫu thể hiện ở hỡnh 3.10 a và 3.10 b cho thấy: mặc dự phương phỏp chiết lỏng – lỏng cũn nhiều tạp hơn so với phương phỏp chiết pha rắn nhưng sắc ký đồ vẫn tỏch ra được pic quan trọng paclitaxel và baccatin III. Phương phỏp chiết pha rắn loại tạp tốt hơn nhưng phương phỏp này cú hạn chế là tốn nhiều thời gian và giỏ thành cao, trong khi cú rất nhiều mẫu sinh khối phải phõn tớch. Vỡ vậy, phương phỏp xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng được lựa chọn cho nghiờn cứu tiếp theo.
AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
Baccatin III Paclitaxel AU
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Minutes 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Baccatin III Paclitaxel
Hỡnh 3.10. Sắc ký đồ mẫu sinh khối thụng đỏ xử lý theo phương phỏp chiết lỏng -lỏng (a) và lỏng - rắn (b) (a) và lỏng - rắn (b)
Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5g chế phẩm đó nghiền mịn vào ống ly tõm 50 ml, thờm 10 ml methanol, lắc xoỏy với tốc độ khoảng 1000 vũng/phỳt trong 5
phỳt, ly tõm với tốc độ 3000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Gạn lấy dịch ly tõm, cắn trong ống ly tõm được chiết như trờn 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml methanol. Gộp cỏc dịch ly tõm, chuyển vào bỡnh gạn đó cú sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n-hexan. Lớp nước được lắc kỹ với dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp cỏc dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat khan, sau khi lọc xong rửa lớp natri sulfat bằng vài ml dicloromethan. Gộp cỏc dịch lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi dung mụi ở 350C dưới dũng khớ nitơ tới cắn. Hũa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, được dung dịch tiờm sắc ký.
* Kết quả khảo sỏt điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký:
Kết quả sắc ký đồ khi tiến hành khảo sỏt trờn cột Fortis phenyl (150ì4,6 mm; 5 àm) với 3 hệ pha động: sắc ký đồ mẫu chuẩn cú xuất hiện pớc, tuy nhiờn khi chạy mẫu thử cỏc pớc khụng tỏch khỏi nhau hoàn toàn, khụng phõn tớch được paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ.
Kết quả sắc ký đồ khi tiến hành khảo sỏt trờn cột Luna L43 (250ì4,6 mm; 5 àm) với ba hệ pha động: Cỏc pớc sắc nột, tỏch khỏi nhau hoàn toàn, pớc đối xứng.
- Pha động: tiến hành khảo sỏt khả năng tỏch paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ với 3 hệ pha động (bảng 3.29).
Bảng 3.29: Khảo sỏt điều kiện pha động Hệ t (phỳt) ACN (%) H2O (%) MeOH (%) Rửa giải 0 - 35 35 65 0 Đẳng dũng 35 - 60 35 - 80 65 – 20 0 Gradient 60 - 70 80 - 35 20 – 65 0 Gradient I 70 - 80 35 65 0 Đẳng dũng II 0 - 60 35 45 20 Đẳng dũng 0 - 45 25 - 63 75 – 37 0 Gradient 45 - 55 63 - 25 37 – 75 0 Gradient III 55 - 60 25 75 0 Đẳng dũng
Kết quả khảo sỏt cho thấy sử dụng hệ III với chương trỡnh chạy gradient cho kết quả phõn tỏch paclitaxel và baccatin III tốt nhất, cỏc pớc tỏch rời nhau, sắc nột, chõn pớc gọn và thời gian phõn tớch phự hợp (hỡnh 3.11).
A U 0 .0 0 0 0 .0 0 5 0 .0 1 0 0 .0 1 5 0 .0 2 0 0 .0 2 5 0 .0 3 0 M in utes 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 .0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0 B a c c a tin III P a c lita xe l
Hỡnh 3.11. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha
động III sử dụng cột Luna L43
- Bước súng: Pha chất chuẩn paclitaxel và baccatin III trong MeOH. Tiến hành quột phổ UV trong khoảng 190 – 400 nm. Kết quả cho thấy paclitaxel cú cực đại hấp thụ tại 228 nm (hỡnh 3.12a) và baccatin III cú cực đại hấp thụ tại 232 nm (hỡnh 3.12b). Vỡ độ hấp thụ của baccatin III ở bước súng 228 nm và 232 nm khỏc nhau khụng nhiều nờn để tiện lợi nghiờn cứu này sử dụng một bước súng 228 nm ỏp dụng cho định lượng cả 2 chất này.
31.137 Peak 1 228.0 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 0.018 0.020 0.022 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 18.620 Peak 1 231.5 274.0 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00
Hỡnh 3.12. Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b)
- Lưu lượng dũng: qua khảo sỏt lưu lượng dũng từ 0,5 - 2 ml/phỳt cho thấy lưu lượng dũng 1,0 ml/phỳt là tối ưu vỡ tỏch riờng được paclitaxel, Baccatin III với cỏc pớc tạp khỏc trong dịch sinh khối tế bào thời gian xuất hiện đỏp ứng pớc sớm.
- Thể tớch tiờm mẫu: tiến hành khảo sỏt thể tớch tiờm mẫu từ 10-100 àl. Kết quả cho thấy, khi tiến hành tiờm mẫu với thể tớch 20 àl cho chõn pớc gọn và cỏc chất tỏch hoàn toàn khỏi nhau.
Từ kết quả trờn, điều kiện HPLC được lựa chọn để định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ là:
+ Pha tĩnh: cột Luna L43 (250 ì 4,6 mm ; 5 àm).
+ Pha động: ACN-H2O chạy theo chương trỡnh gradient với hệ pha động III (Bảng 3.30). Bảng 3.30. Chương trỡnh chạy sắc ký Thời gian (phỳt) ACN (%) H2O (%) 0 - 45 25 – 63 75 - 37 45 - 55 63 – 25 37 - 75 55 - 65 25 75 + Bước súng: 228 nm + Tốc độ dũng: 1 ml/phỳt. + Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl. * Kết quả thẩm định quy trỡnh định lượng
- Tớnh đặc hiệu và tương thớch của hệ thống sắc ký
Tiến hành phõn tớch mẫu trắng, mẫu hỗn hợp 2 chuẩn paclitaxel và baccatin III cú nồng độ 10 àg/ml và mẫu thử sinh khối thụng đỏ. Kết quả ở hỡnh 3.13 và bảng 3.31 cho thấy trong mẫu trắng khụng cú pớc tại cỏc thời điểm xuất hiện cỏc pớc của paclitaxel và baccatin III; cỏc pớc cõn đối, tỏch
nhau rừ ràng; thời gian lưu (tR) và diện tớch pớc (μV*giõy) của paclitaxel và baccatin III chuẩn cú độ lặp lại cao (độ lệch chuẩn RSD < 1%).
AU -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 Minutes 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Baccatin III Paclitaxel 18 .565 31. 0 3 2 AU 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 Minutes 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
Baccatin III Paclitaxel
Hỡnh 3.13. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b).
Bảng 3.31. Độ lặp lại của hệ thống
Paclitaxel Baccatin III
STT TR (phỳt) S (μV*giõy) TR (phỳt) S (μV*giõy) 1 31,22 201879 18,55 129541 2 31,04 203589 18,69 126198 3 31,14 203598 18,59 128087 4 31,03 202387 18,66 128098 5 31,13 202780 18,64 128102 TB 31,11 202941 18,63 128015 RSD (%) 0,25 0,37 0,31 0,92
- Khoảng tuyến tớnh của paclitaxel và baccatin III
Pha cỏc hỗn hợp chuẩn cú nồng độ 5; 10; 20; 50; 80 và 100 àg/ml trong methanol. Tiến hành chạy sắc ký cỏc mẫu để xỏc định diện tớch pic của paclitaxel và baccatin III ở cỏc nồng độ khỏc nhau. Kết quả ở bảng 3.31 và hỡnh 3.14 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sỏt, diện tớch pớc và nồng độ paclitaxel và baccatin III cú sự tương quan tuyến tớnh với R2 ~ 1.
Bảng 3.32. Sự phụ của diện tớch pớc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III
Diện tớch pớc (àV*s) Nồng độ (àg/ml)
Paclitaxel Baccatin III
5 93395 59921 10 203336 128307 20 403131 264345 50 1020613 645826 80 1618654 1027586 100 2068974 1337309 Y = aX + b Y = 20610X - 8919,2 Y = 13229X - 7051,4 R2 0,9998 0,9991 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 0 50 100 150 Paclitaxel Baccatin III Nồng độ (μg/ml) Di ệ n t ớc h pi c ( μ V* s) Hỡnh 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tớch pớc và nồng độ