Khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung trong khoảng từ 10 đến 100 mV được kết quả bảng 3.34.
Quan sát ở bảng 3.34, trong khoảng biên độ xung khảo sát từ 10 đến 60 mV dòng
đỉnh hòa tan (Ip) tăng nhanh với biên độ xung và gần như tuyến tính với hệ số tương quan R2 = 0,9935. Khi biên độ xung từ 60 đến 100 mV thì Iptăng chậm và đạt cực đại
ở 80 mV và ởđó độ nhạy là lớn nhất với 0,0267 A/ppb. Do đó, chúng tôi chọn giá trị
Bảng 3.34.Ảnh hưởng của biên độ xung (ΔE) đến tín hiệu Ip
ΔE (mV) Ep-TB (V) (a) Ip-TB (µA) (a) RSD (%) (b) Độ nhạy (c)
10 0,471 0,8402 0,151 0,0053 20 0,473 1,697 0,206 0,0113 30 0,472 2,508 0,175 0,0166 40 0,470 3,067 0,130 0,0203 60 0,465 3,765 0,210 0,0250 80 0,456 4,015 0,169 0,0267 100 0,446 3,966 1,846 0,0265 ĐKTN: nhưở bảng 3.28; sử dụng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO, số lớp là 4 và số vòng quét tạo P(BCP) là 50, nồng độ tạo P(BCP) là 5.10-4 M, pH = 5,5 và Edep = –100 mV. 3.6.5.4. Ảnh hưởng của tốc độ quét
Vì tốc độ quét thế (v) ảnh hưởng đến dạng đường von – ampe hòa tan. Thêm vào
đó, tốc độ quét thế là một đại lượng rất quan trọng khi nghiên cứu quá trình trao đổi
điện tử xảy ra trên bề mặt điện cực làm việc. Do hạn chế của thiết bị trong nghiên cứu, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ quét thế từ 20 đến 120 mV/s thu được kết quả bảng 3.35, hình 3.66, 3.67.
Bảng 3.35.Ảnh hưởng của tốc độ quét thếđến tín hiệu hòa tan Ip
v (mV/s) Ep-TB (V) (a) Ip-TB (µA) (a) RSD (%) (b) Độ nhạy (c)
20 0,457 2,200 0,173 0,015 40 0,462 2,736 0,132 0,018 60 0,466 3,517 0,250 0,023 80 0,468 3,944 0,167 0,026 100 0,469 4,003 0,202 0,027 120 0,471 4,136 0,070 0,027 ĐKTN: như ở bảng 3.2; sử dụng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO, số lớp là 4 và số vòng quét tạo P(BCP) là 50, nồng độ tạo P(BCP) là 5.10-4 M, pH = 5,5, Edep = –100 mV và ΔE = 80 mV.
Hình 3.63. Hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa Ip vào v1/2.
Từ kết quả ở bảng 3.35 và hình 3.63, nhận thấy khi tăng tốc độ quét từ 20 đến 120 mV/s hay từ 0,020 đến 0,120 V/s, Ip của UA tăng tuyến tính với căn bậc hai của tốc độ quét thế (v½) với r = 0,9719. Điều này chứng tỏ quá trình diễn ra trên bề mặt
điện cực được điều khiển bởi sự khuếch tán.
Mặt khác, tốc độ quét thế không chỉ ảnh hưởng đến tín hiệu dòng hòa tan mà còn ảnh hưởng đến thế đỉnh hòa tan (Ep). Khi tốc độ quét thế tăng dần thì Ep có xu thế
dịch chuyển dương hơn (bảng 3.35). Nếu biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa Ep
với giá trị ln(v) ta có phương trình (3.41) và hình 3.64:
Ep = 0,487 + 0,0179 lnv ; r = 0,9968 (3.41)
Theo Laviron E. (1979), đối với quá trình bất thuận nghịch và xuất hiện dòng anot thì giữa giá trị Epcủa chất phân tích và giá trị lnv được biểu diễn qua công thức (3.13) [35]:
Hình 3.64. a. Hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa Ep vào lnv; b. Hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa Ep vào v
Trong đó, E0: thế tiêu chuẩn của cặp oxi hóa – khử (V);
n: số electron trao đổi; R: hằng số khí (8,314 J/mol.K); T: nhiệt độ (0K), xét ở 25oC, T = 298oK; F: hằng số Faraday (96500 C/mol); α: là hệ số chuyển điện tử; Ks: hằng số tốc độ chuyển điện tử.
Như vậy, từ độ dốc của phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối quan hệ
giữa Ep và lnv ta có:
Và
Theo [8, 142], sốđiện tử trao đổi của UA là 2, suy ra α≈ 0,283 (ở 25oC). Thêm vào đó, theo Yang S. và cộng sự (2010) [168] cho rằng khi biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa Ep vào v thì giá trị thế tiêu chuẩn (Eo) của cặp oxy hóa khử
liên hợp chính là hệ số chắn của phương trình hồi quy. Xuất phát từ vấn đề đó, chúng tôi xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa Ep vào v thu được phương trình (3.45) và hình 3.64 b.
Ep = 0,4562 + 0,1329 v ; r = 0,9523 (3.45) Với giá trịr như vậy là tuyến tính và do đó, có thể xác định giá tri Eo của UAkhử /
UAoxy hóa là 0,4562 so với điện cực so sánh bạc. Vậy từ phương trình (3.42) và α =
0,283 tính được giá trị hằng số tốc độ của phản ứng (Ks) là 9,88 s–1.
Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ quét thế, chọn giá trị thích hợp là 80 mV/s. Ep = E - + lnRT v (1-α)nF ln RTKs (1-α)nF RT (1-α)nF (3.42) RT (1-α)nF = 0,0179 (3.43) RT (1-α)nF ln RTKs (1-α)nF Eo - = 0,487 (3.44)
3.6.6. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
3.6.6.1. Độ lặp lại của tín hiệu hòa tan
Tín hiệu hòa tan của UA bao gồm hai đại lượng là thếđỉnh hòa tan (Ep) và dòng
đỉnh hòa tan (Ip). Qua một số kết quả nghiên cứu cho thấy Ep của UA là khác nhau không nhiều và do đó chỉ lựa chọn Ipđể đánh giá độ lặp lại, bởi vì đây là tín hiệu ảnh hưởng đến độ nhạy và giới hạn phát hiện cũng như là định lượng. Độ lặp lại của Ip trên
điện cực GCE/P(BCP)/ZnO được xác định qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD (%)) của chúng. Cốđịnh các điều kiện thí nghiệm đã được khảo sát và tiến hành các thí nghiệm (TN) riêng rẽ với 3 nồng độ của UA khác nhau là 10 µM; 80 µM và 150 µM. Mỗi nồng
độ tiến hành 2 thí nghiệm song song trong cùng một dung dịch nghiên cứu. Kết quảở
hình 3.65, bảng 3.36.
Kết quả thu được cho thấy, độ lặp lại của Ip-UA ở cả ba nồng độ có giá trị sai số
tương đối chuẩn (RSD) dao động trong khoảng từ 0,6% đến 2,6%. Và do đó, độ lặp lại là rất tốt, điều này được thể thiện trên các đường von-ampe hòa tan gần như trùng khít nhau (hình 3.65). Hơn nữa, so với RSD tính theo hàm Horwizt thì các giá trị RSD ở ba nồng độđều nhỏ hơn rất nhiều.
a B c
Hình 3.65. Các đường von – ampe hòa tan của UA khi thực hiện 9 phép đo lặp lại trong cùng một dung dịch nghiên cứu a. TN2, b; TN4 và c. TN6
Bảng 3.36. Kết quảđánh giá độ lặp lại của Ip-UAở các nồng độ khác nhau Ip (µA) CUA = 10 M CUA = 80 M CUA = 150 M Lần đo TN 1 TN 2 TN 3 TN 4 TN 5 TN 6 1 1,134 1,203 4,952 5,417 8,606 9,097 2 1,155 1,183 5,297 5,372 8,886 9,028 3 1,172 1,157 5,319 5,426 8,926 9,037 4 1,172 1,151 5,335 5,375 8,916 9,048 5 1,173 1,152 5,431 5,369 8,928 9,157 6 1,169 1,148 5,347 5,341 8,946 9,104 7 1,177 1,150 5,344 5,336 8,953 9,158 8 1,169 1,147 5,359 5,497 8,999 9,180 9 1,176 1,144 5,337 5,356 8,992 9,080 Ip-TB (µA) (a) 1,166 1,159 5,302 5,388 8,906 9,099 RSD (%) (b) 1,184 1,717 2,571 0,950 1,323 0,617 RSDH (%) (c) 20,93 10,82 9,84 ĐKTN: nhưở bảng 3.28; sử dụng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO, số lớp là 4 và số vòng quét tạo P(BCP) là 50, nồng độ tạo P(BCP) là 5.10-4 M, pH = 5,5, Edep = –100 mV, ΔE = 80 mV và v = 80 mV/s.
Như vậy, có thể cho rằng điện cực biết tính GCE/P(BCP)/ZnO là hoàn toàn chấp nhận được khi sử dụng phương pháp DP-ASV xác định UA.
3.6.6.2. Khoảng tuyến tính
Tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp DP-ASV dùng điện cực biến tính GCE/P(BCP)/ZnO trong khoảng nồng độ của UA từ 0 đến 160 µM.
Quá trình thí nghiệm như sau: chuẩn bị dung dịch PBS (pH = 5,5) và ghi tín hiệu mẫu trắng; sau đó, thêm UA vào dung dịch nghiên cứu, thêm 8 lần, mỗi lần thêm 50µL dung dịch UA 4.10-3 M, ghi đường von – ampe hòa tan và xác định Ip. Kết quả từ ba thí nghiệm độc lập thu được ở hình 3.66, bảng 3.36.
A) TN1 B) TN2 C) TN3
Hình 3.66. Các đường von – ampe hòa tan của UA ghi được khi xác định
khoảng tuyến tính của phương pháp
Kết quả cho thấy, giữa Ip-UA và nồng độ UAcó tương quan tuyến tính rất tốt trong khoảng nồng độ từ 0 đến 160 µM với hệ số tương quan của phương trình hồi quy tuyến tính, rTB là 0,9995 (n = 3), hình 3.67
Bảng 3.37. Kết quả xác định khoảng tuyến tính của phương pháp DP-ASV.
CUA (M) Thông số 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Ip-TB (µA) (a) 0 1,291 2,449 3,597 4,662 5,758 6,856 7,854 8,858 TN 1 RSD (%) (b) - 0,349 0,225 0,545 0,097 0,314 1,025 0,349 0,278 Ip-TB (µA) (a) 0 1,366 2,567 3,716 4,841 5,94 7,008 8,104 9,176 TN 2 RSD (%) (b) - 0,344 0,273 0,684 0,481 0,463 0,532 0,497 0,800 Ip-TB (µA) (a) 0 1,083 2,173 3,122 4,109 5,077 6,016 6,96 7,943 TN 3 RSD (%) (b) - 0,536 0,064 0,311 0,277 0,652 0,264 0,346 1,852
(a): giá trị trung bình với n = 4, (b): độ lệch chuẩn tương đối.ĐKTN: nhưở bảng 3.36.
3.6.6.3. Giới hạn phát hiện và độ nhạy
Xuất phát từ hình 3.67 và bảng 3.37, áp dụng phương pháp bình phương tối thiểu xây dựng phương trình hối quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa Ip vào CUA, theo dạng: Ip = a + b CUA. Sau đó, xác định độ nhạy, giới hạn phát hiện (GHPH) và giới hạn định lượng (GHĐL) của phương pháp dựa vào đường chuẩn [105]. Kết quả được trình bày ở bảng 3.38. Bảng 3.38. Các giá trị a, b, Sy, r , GHPH và GHĐL Thí nghiệm a Sa (µA) b Sb (µA/M) Sy/x r GHPH, µM GHĐL, µM TN 1 0,185 ± 0,067 0,055 ± 0,001 0,109 0,9994 5,957 19,82 TN 2 0,212 ± 0,069 0,057 ± 0,001 0,113 0,9994 5,972 19,82 TN 3 0,117 ± 0,042 0,049 ± 0,000 0,069 0,9997 4,216 14,08 TB (n = 3) 0,171 0,054 0,097 0,9995 5,382 17,91
Kết quảở bảng 3.38 cho thấy, trong điều kiện thí nghiệm thích hợp, phương pháp DP – ASV dùng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO nhận được GHPH khá thấp, khoảng 6 µM
đối với UA, tương ứng với GHĐL khoảng từ 14 đến 20 µM. Độ nhạy của phương pháp
đạt được cũng tương đối cao, 0,054 (µA/µM) đối với UA. Như vậy, có thể áp dụng phương pháp này để xác định hàm lượng của UA trong các mẫu sinh học như mẫu nước tiểu và mẫu máu.
3.6.6.4. Áp dụng thực tế
Việc áp dụng phương pháp DP – ASV dùng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO để xác
định UA trong mẫu thực tế, chúng tôi lựa chọn đối tượng phân tích là mẫu nước tiểu và mẫu máu.
- Đối với mẫu nước tiểu, do không có điều kiện chúng tôi chỉ lấy mẫu của người bình thường vào buổi sáng sớm chứ không lấy liên tục trong 24 giờ. Mẫu sau khi lấy mang lên phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.
- Đối với mẫu máu, chúng tôi lấy mẫu máu của một số bệnh nhân đến khám tại Phòng khám sức khỏe nghề nghiệp, Trung tâm Y tế dự phòng, tỉnh Thừa Thiên Huế. Mẫu máu sau khi lấy được tiến hành ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút ở nhiệt độ
¾ Lý lịch mẫu
Mẫu nước tiểu và mẫu huyết thanh được tổng hợp trong bảng 3.39.
Bảng 3.39. Lý lịch mẫu nước tiểu và mẫu huyết thanh
Mẫu nước tiểu Mẫu huyết thanh
Mẫu
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Kí hiệu NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 HT1 HT2 HT4 HT5 HT6
Đối
tượng Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nữ
Tuổi 51 28 26 22 26 44 29 27 26 40
¾ Phân tích mẫu thực tế
* Đánh giá độđúng
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả [138, 142] khi xác định hàm lượng của UA trong đối tượng mẫu nước tiểu và mẫu huyết thanh không cần qua giai đoạn tiền xử lý mẫu và do đó, chúng tôi cũng không tiến hành tiền xử lý mẫu.
Để xác định hàm lượng UA trong hai đối tượng mẫu, trước hết tiến hành xác định
độ đúng của phương pháp DP – ASV dùng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO trên mẫu thật thêm chuẩn (spike samples). Các mẫu thật được lựa chọn như sau:
- Mẫu nước tiểu là mẫu NT2 và NT5. Quá trình tiến hành thí nghiệm như sau: Thí nghiệm 1 (TN1) – phân tích mẫu thật không thêm chuẩn (no spike): Lấy 100 µL dung dịch mẫu vào bình điện phân. Thêm vào 1,000 mL dung dịch đệm photphate 1,000M (pH = 5,5) và nước cất 2 lần cho vừa đủ 10 mL. Tiến hành xác định UA bằng phương pháp DP-ASV dùng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO và định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn, mỗi lần thêm chuẩn là 50 µL UA 4.10–3 M. Từ đó xác định hàm lượng UA trong mẫu theo công thức (3.46).
Trong đó: - Cmẫu: nồng độ UA trong mẫu ban đầu (µM); - Cbđp: nồng độ UA trong bình điện phân (µM);
- Vbđp: thể tích dung dịch trong bình điện phân – 10 mL; - Vmẫu: thể tích dung dịch mẫu – 0,100 mL.
Vbđp Vmẫu
Thí nghiệm 2 (TN2) – phân tích mẫu thật thêm chuẩn (spike sample): Lấy 1,000 mL dung dịch mẫu vào ống polyetylene, sau dó thêm vào 0,200 mL dung dịch chuẩn UA 4.10–3 M rồi tiến hành lắc đều, gọi là mẫu thật thêm chuẩn (SS). Lấy 120 µL dung dịch SS vào bình điện phân. Thêm vào 1,000 mL dung dịch đệm photphat 1,000M (pH = 5,5) và nước cất 2 lần cho vừa đủ 10 mL. Tiến hành xác định UA bằng phương pháp DP- ASV dùng điện cực GCE/P(BCP)/ZnO và định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn, mỗi lần thêm chuẩn là 50 µL UA 4.10–3 M. Từ đó xác định hàm lượng UA trong mẫu theo công thức (3.46).
- Mẫu huyết thanh là mẫu HT5 và HT6. Quá trình thí nghiệm hoàn toàn tương tự
nhưđối với mẫu nước tiểu.
Đối với TN1 lấy 200 L mẫu huyết thanh đem xác định UA.
Đối với TN2: + Mẫu HT5 lấy 500 µL mẫu huyết thanh và 45 µL dung dịch UA 4.10–3 M, lắc đều. Sau đó lấy 200 µL cho vào bình điện phân và xác định UA.
+ Mẫu HT6 lấy 500 L mẫu huyết thanh và 25 µL dung dịch UA 4.10–3 M. Sau đó lấy 200 µL cho vào bình điện phân và xác định UA
Khi đó độ hồi phục được tính bởi công thức [105]:
Trong đó, C0 (μM) là nồng độ chất phân tích được thêm chuẩn vào trong mẫu thật; C1 (μM) là nồng độ chất phân tích trong mẫu thật; C2 (μM) là nồng độ chất phân tích trong mẫu thật đã được thêm chuẩn (μM).
Kết quả xác định các mẫu nước tiểu, mẫu huyết thanh và độ thu hồi được trình bày ở bảng 3.40 và bảng 3.41.
Bảng 3.40.Độ thu hồi của một số mẫu nước tiểu (a)
Mẫu CUA (μM) – TN1 CUA thêm (μM) CUA tìm thấy (μM) – TN2 Rev (%)
NT2 1881 - 7 800 2734 - 10 106,6
NT5 2119 - 9 800 2932 - 11 101,7
(a): giá trị trung bình với n = 3, ĐKTN: nhưở bảng 3.36.
C2 – C1