2.3.2.1. Phương pháp định lượng dược chất
a) Phương pháp định lượng dược chất bằng HPLC [25]: * Điều kiện sắc ký [25]:
+ Pha động: ACN: H2O: TFA 1% = 37: 62: 1 (v/v)
+ Pha tĩnh: Cột Shimadzu (250 mm x 4,6 mm), C18, 5 µm. + Detector UV đặt ở bước sóng 242 nm.
+ Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. Nhiệt độ cột: 40°C. * Chuẩn bị mẫu:
+ Dung môi pha loãng: ACN: H2O (25:75).
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 50mg calci rosuvastatin vào bình định mức 100 ml, hòa tan bằng dung môi pha loãng, bổ sung vừa đủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung môi pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 50 - 250µg/ml.
+ Dung dịch chuẩn làm việc (150µg/ml): Hút chính xác 3ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml, thêm vừa đủ bằng dung môi pha loãng.
+ Dung dịch thử: Pha loãng mẫu thử trong dung môi pha loãng ở tỷ lệ nhất định để được dung dịch thử có nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 50 - 250µg/ml.
* Công thức tính hàm lượng %
HL (%): Hàm lượng calci rosuvastatin trong SNEDDS so với lý thuyết
St: Diện tích pic của mẫu thử
Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn
Cc: Nồng độ calci rosuvastatin của mẫu chuẩn (mg/ml)
V: Thể tích mẫu thử (ml) K: Độ pha loãng của mẫu thử
m: hàm lượng calci rosuvastatin trong SNEDD theo lý thuyết (mg) * Thẩm định phương pháp định lượng
Độ thích hợp hệ thống: Tiêm lặp lại 6 mẫu với cùng một nồng độ (150µg/ml). Yêu cầu: RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và diện tích pic ≤ 2,0%, hệ số kéo đuôi của pic chính ≤ 2,0.
Độ tuyến tính: Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn, lập phương trình hồi quy, xác định hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ calci rosuvastatin có trong mẫu và đáp ứng pic. Yêu cầu: R ≥ 0,998.
Độ đặc hiệu: Tiến hành chạy sắc ký các dụng dịch: dung dịch chuẩn (150µg/ml), dung dịch trắng, dung dịch placebo, dung dịch thử. Yêu cầu: thời gian lưu của dung dịch thử tương tự thời gian lưu của dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu placebo không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic calci rosuvastatin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
b) Phương pháp định lượng dược chất bằng đo quang phổ UV – VIS [2]: Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 242nm [2].
Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 37,5 mg calci rosuvastatin vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng 35 ml dung môi, lắc siêu âm 10 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng. Bổ sung vừa đủ đến vạch bằng dung môi, lắc đều (dung dịch A).
Dung dịch chuẩn: Pha loãng dung dịch A để thu được dãy chuẩn có nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 6 - 18µg/ml.
Mẫu trắng: là dung môi ACN:nước (25:75).
Mẫu thử: pha loãng mẫu thử trong dung môi ACN:Nước (25:75) ở tỷ lệ nhất định để được dung dịch thử có nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 6 - 18μg/ml [2].
• Thẩm định phương pháp phân tích
Độ thích hợp hệ thống: Đo độ hấp thụ lặp lại 6 mẫu với cùng một nồng độ (12µg/ml). Yêu cầu giá trị RSD của độ hấp thụ ≤ 2,0 %
Độ tuyến tính: Xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang
vào nồng độ calci rosuvastatin. Yêu cầu: đường chuẩn tuyến tính trong khoảng độ
hấp thụ quang từ 0,2 đến 0,8 và R > 0,998.
Độ đặc hiệu: Tiến hành quét phổ UV - VIS các dung dịch: dung dịch mẫu placebo, dung dịch chuẩn 12µg/ml, dung dịch thử. Yêu cầu: mẫu placebo không hấp thụ tại bước sóng 242 nm.
2.3.2.2. Đánh giá dịch vỏ nang
a) Tính chất
Dịch nhớt, trong, màu vàng đậm. Đánh giá bằng mắt thường: quan sát màu sắc, độ trong, mức độ bọt của dịch.
b) Độ nhớt của dịch vỏ nang
Độ nhớt của dịch vỏ nang được đánh giá tham khảo phương pháp mô tả bởi Kalkandelen và cộng sự [35]:
Cân xác định 1 lượng dịch vỏ nang, pha loãng gấp đôi với nước cất. Đun cách thủy hỗn hợp ở 60°C trong 30 phút, khuấy đều thu được dịch đồng nhất. Tiến hành đo độ nhớt bằng máy đo độ nhớt Brookfield với spindle 2, tốc độ quay 60 rpm ở 60°C.
c) Độ bền gel của dịch vỏ
Tiến hành tương tự theo phương pháp đánh giá độ bền gel trong DĐVN V [1]:
Cân chính xác một lượng dịch vỏ nang thêm nước vừa đủ để thu được dung dịch có nồng độ gelatin 6,67%. Đun cách thủy hỗn hợp ở 65°C trong 15 phút, thỉnh thoảng khuấy đến khi thu được dịch đồng nhất, để nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Làm lạnh dịch vỏ nang ở nhiệt độ 10°C trong 16 – 18 giờ trong bể điều nhiệt. Tiến hành đo độ bloom trên thiết bị Texture Analyzer CT3 1500.
Thời gian hòa tan gelatin được tính từ khi đặt hỗn hợp gelatin đã ngâm trương nở vào bình cách thủy ở nhiệt độ 60-70°C đến khi các hạt gelatin chảy lỏng hoàn toàn tạo dung dịch lỏng, nhớt và đồng nhất (quan sát bằng mắt).
2.3.2.3. Đánh giá màng vỏ nang
a) Tạo màng vỏ nang
• Chỉnh kích thước độ dày trên khuôn theo yêu cầu thiết kế thí nghiệm. • Sấy làm nóng khuôn ở 60°C trong khoảng 30 phút.
• Tráng 1 lớp mỏng dầu parafin lên khuôn.
• Đổ dịch vỏ nang lên khuôn rồi tiến hành cán tạo màng vỏ nang.
• Làm lạnh khuôn bằng tủ làm mát kangaroo ở nhiệt độ 18- 200C trong 15-
20 phút sau đó bóc vỏ nang khỏi khuôn. • Làm khô màng vỏ nang
Màng vỏ nang được làm khô ở điều kiện nhiệt độ 21 - 24°C, độ ẩm 25 - 30 % đến khi độ ẩm màng đạt 9 - 14%. Xác định độ ẩm màng vỏ nang: cắt nhỏ màng vỏ nang, xác định hàm ẩm bằng cân xác định độ ẩm nhanh MF50 (Nhật) ở nhiệt độ
1050C.
b) Phương pháp đánh giá màng vỏ nang • Độ dày và độ đồng đều vỏ
Đánh giá độ dày và độ đồng đều màng vỏ nang: Màng vỏ nang bào chế có kích thước 10cm x 15cm. Sử dụng thiết bị kẹp đo có độ chính xác đến 0,01 mm để đo độ dày màng vỏ nang ở các điểm khác nhau (theo sơ đồ thể hiện trong hình 2.1).
Hình 2.1. Vị trí đo độ đồng đều màng vỏ nang
• Lực kéo đứt và khả năng kéo giãn
Lực kéo đứt màng vỏ nang được đánh giá tham khảo phương pháp mô tả bởi Chamnanvatckatit và cộng sự [14] như sau:
Chuẩn bị mẫu: Cắt các mẫu màng vỏ nang có kích thước dài 5cm, rộng 0,5cm và cùng độ dày đồng nhất.
Tiến hành: các mẫu màng vỏ nang được kẹp vào giữa 2 đầu kẹp của thiết bị đo Texture Analyzer CT3 1500 sao cho khoảng cách giữa 2 đầu kẹp là 1,0 cm.
Thông số hoat động của thiết bị:
+ Lực kéo (Trigger): 100,0g + Chương trình đo: Tension
+ Khoảng cách kéo (Deformation):100,0mm + Tốc độ đo (Speed): 5,0mm/s
Các kết quả đọc được:
+ Peak load: Lực tải tối đa làm đứt mẫu (g lực)
+ Defopeak: Vị trí mẫu bị đứt (mm)
Công thức tính lực kéo đứt
Lực kéo đứt (N)= Giá trị lực tải tối đa làm đứt mẫu (g lực)* 0,00980665
Công thức tính khả năng kéo giãn:
Khả năng kéo giãn (%) = 𝐿−𝐿0
𝐿0 x 100%
L: độ dài khi đứt màng (mm)
L0: độ dài màng ban đầu(mm)
• Khả năng hòa tan màng vỏ nang Điều kiện thử hòa tan [25]:
+ Thiết bị: máy thử hòa tan cánh khuấy
+ Tốc độ quay 50 vòng/phút, nhiệt độ: 37± 0,5⁰C + Thể tích môi trường: 900ml.
+ Môi trường hòa tan: dung dịch đệm citrat 0,05M pH 6.6
Tiến hành: Màng vỏ nang được cắt thành các mẫu có kích thước đều nhau
2x2cm, khối lượng khoảng 0,20 ± 0,01g. Thời gian hòa tan màng vỏ nang được tính từ khi thả mẫu vào cốc hòa tan đến khi màng vỏ nang tan hoàn toàn (không còn cắn vỏ nang dưới đáy cốc hòa tan).
• Thời gian rã màng vỏ nang
Tham khảo DĐVNV, phụ lục 11.6, chuyên luận thuốc nang mềm PL 20
Tiến hành: Màng vỏ nang được cắt màng thành các mẫu có kích thước đều nhau 2x2 cm, khối lượng khoảng 0,2 ± 0,01g. Mẫu thử được coi là rã nếu không còn cắn trên mặt lưới.
2.3.2.4. Đánh giá SNEDDS rosuvastatin.
Cân chính xác một lượng SNEDDS rosuvastatin tương ứng với khoảng 60mg calci rosuvastatin cho vào cốc có mỏ 25 ml, thêm 5 ml nước, khuấy từ 50 vòng/phút trong 3 phút, thu được nano nhũ tương. Nano nhũ tương được đánh giá các chỉ tiêu chất lượng như sau:
a) Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt của nano nhũ tương [2]:
Hút 2ml nano nhũ tương vào bình định mức 10 ml, bổ sung nước đến vạch, lắc đều. Kích thước giọt trung bình và chỉ số đa phân tán (PDI) của nano nhũ tương được đo dựa trên kĩ thuật tán xạ ánh sáng động (dynamic light scaterring) theo thuyết tán xạ Mie, sử dụng thiết bị Zetasizer (Nano ZS90, Anh). Các phép đo được thực hiện ở nhiệt độ 25°C, góc đo 90°, sử dụng cuvet thủy tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,843 và độ hấp thụ là 0,001.
b) Đánh giá độ ổn định vật lý của nano nhũ tương tạo thành [2]:
Cho nano nhũ tương vào ống ly tâm, ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Nhũ tương được coi là ổn định khi không có sự tách lớp sau khi ly tâm [2].
c) Xác định tỷ lệ dược chất được nano nhũ hóa [2]:
Hút chính xác một lượng nano nhũ tương, pha loãng đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính 6 - 18μg/ml lần lượt bằng dung môi acetonitril và nước cất (25: 75), định lượng nồng độ dược chất trong nano nhũ tương bằng quang phổ UV-VIS ở bước sóng 242 nm, từ đó tính được hàm lượng (HL) dược chất trong nano nhũ
tương ban đầu (Tổng HL dược chất trong nhũ tương).
Hút 3 ml nano nhũ tương vừa tạo thành vào ống siêu ly tâm, ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 3 phút, thu được pha nước ở phía dưới ống. Hút chính xác một lượng ở pha nước, pha loãng đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính 6 - 18μg/ml lần lượt bằng dung môi acetonitril và nước cất. Định lượng nồng
độ dược chất trong pha nước bằng quang phổ UV-VIS ở bước sóng 242 nm. Từ đó
tính được hàm lượng dược chất trong pha nước (HL dược chất pha nước) thức [2].
Tỷ lệ dược chất được nano nhũ hóa tính theo công thức
(Tổng HL dược chất trong nhũ tương – HL dược chất pha nước)
TLDC = x100
Tổng HL dược chất trong nhũ tương
2.3.2.5. Đánh giá viên nang mềm chứa SNEDDS rosuvastatin hàm lượng 10mg. a) Tính chất
Đánh giá hình thức viên nang: hình dạng, màu sắc, độ trong.
b) Định tính
Tiến hành định tính calci rosuvastatin bằng cách so sánh thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ tại bước sóng 242 nm của mẫu thử với chất chuẩn trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trên sắc ký đồ, thời gian lưu của mẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu của mẫu calci rosuvastatin chuẩn.
c) Định lượng
• Điều kiện sắc ký, cách pha mẫu chuẩn, dung môi pha mẫu tương tự mô tả trong mục 2.3.2.1.
• Mẫu thử: Cân và xác định chính xác khối lượng của 20 nang. Dùng kéo nhọn mở nang, chuyển toàn bộ lượng thuốc trong nang vào cốc có mỏ nhỏ, trộn đều. Rửa vỏ nang bằng ether, để cho khô. Tính khối lượng trung bình thuốc trong nang. Khối lượng thuốc trong nang là hiệu số giữa khối lượng nang thuốc và khối lượng vỏ nang. Cân chính xác một lượng thuốc trong nang tương đương 30mg calci rosuvastatin vào bình định mức 20ml, bổ sung vừa đủ bằng dung môi pha mẫu. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên vào bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đủ bằng dung môi, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm.
d) Đánh giá độ hòa tan viên nang mềm
• Điều kiện thử hòa tan[25]:
Thiết bị: máy thử hòa tan cánh khuấy
Tốc độ quay 50 vòng/phút, nhiệt độ: 37± 0,5⁰C Thể tích môi trường: 900ml.
Môi trường hòa tan: dung dịch đệm citrat 0,05M pH 6,6 Thời gian thử hòa tan: 60 phút.
• Phương pháp định lượng dược chất trong mẫu thử hòa tan
Điều kiện sắc ký: tương tự mô tả trong mục 2.3.2.1
Dung môi pha loãng: dung dịch đệm citrat 0,05M pH 6,6.
Dung dich chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 30mg calci rosuvastatin vào bình định mức dung tích 500 ml, thêm khoảng 100 ml đệm, lắc đều đến khi thấy tan hết. Bổ sung thể tích bằng đệm đã lọc qua màng lọc PTFE 0,45µm, lắc đều. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung môi pha loãng để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 3 - 18 µg/ml.
Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 2ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức dung tích 10ml, bổ sung thể tích vừa đủ bằng dung môi pha loãng, lắc đều.
Mẫu thử: Hút chính xác 3ml mẫu thử hòa tan tại thời điểm t = 30, 60 phút, lọc dịch hòa tan qua màng lọc PTFE 0,45 µm vào vial. Bổ xung thể tích môi trường sau mỗi lần lấy mẫu.
* Thẩm định phương pháp: Phương pháp định lượng trong thử độ hòa tan được thẩm định các chỉ tiêu: độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ đặc hiệu tương tự như đã mô tả trong thẩm định phương pháp HPLC định lượng dược chất 2.3.2.1.a.
Công thức tính độ hòa tan của viên nang:
HT: Độ hòa tan của viên nang (%) St: Diện tích pic của mẫu thử Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn
Cc: Nồng độ dược chất của mẫu chuẩn (mg/ml) m: Hàm lượng calci rosuvastatin trong viên (mg)
e) Đánh giá độ đồng đều hàm lượng [1]:
St x Cc x 900
HT = x 100
Tham khảo DĐVN V, phụ lục 11.2, phương pháp 1[1]. Kết quả được đánh giá như sau:
Chế phẩm đạt yêu cầu phép thử, nếu có không quá một đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85 % đến 115 % và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 75 % đến 125 % của hàm lượng trung bình.
Chế phẩm không đạt yêu cầu phép thử nếu có quá ba đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85 % đến 115 %, hoặc có một hay nhiều đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 75 % đến 125 % của hàm lượng trung bình. Nếu hai hoặc ba đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85 % đến 115 %, nhưng ở trong giới hạn từ 75 % đến 125 % của hàm lượng trung bình, thử lại trên 20 đơn vị khác lấy ngẫu nhiên.
Chế phẩm đạt yêu cầu phép thử, nếu có không quá ba trong tổng số 30 đơn vị đem thử có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85 % đến 115% và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 75 % đến 125 % của hàm lượng trung bình.
f) Đánh giá độ ẩm vỏ viên nang mềm
Cắt nhỏ vỏ viên nang mềm, cân chính xác khoảng 1,5g vỏ viên, xác định
hàm ẩm bằng cân xác định độ ẩm nhanh MF50 (Nhật) ở nhiệt độ 1050C.