Các kết quả thu được sẽ được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2010 và được trình bày dưới dạng TB ± SD hoặc TB ± RSD trong đó TB là giá trị trung bình, SD là độ lệch chuẩn, RSD là độ lệch chuẩn tương đối.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thẩm định một số chỉ tiêu của các phương pháp định lượng dược chất
3.1.1. Phương pháp định lượng dược chất bằng HPLC
a) Phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong SNEDDS, viên nang mềm chứa SNEDDS rosuvastatin bằng HPLC
• Độ thích hợp hệ thống
Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn calci rosuvastatin có nồng độ 150µg/ml. Kết quả cho thấy điều kiện sắc ký phù hợp để định lượng calci rosuvsatatin: thời gian lưu 14,909 phút có RSD là 0,12 (%) < 1%, diện tích pic có RSD là 0,05% < 2%, hệ số kéo đuôi có RSD 0,05% < 2%. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống trình bày ở phụ lục 1.
• Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phương pháp đạt yêu cầu với kết quả: Trên sắc ký đồ dung dịch thử cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic calci rosuvastatin của dung dịch chuẩn. Mẫu trắng và mẫu placebo không xuất hiện các pic có thời gian lưu trùng với pic calci rosuvastatin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Hình ảnh sắc ký đồ được trình bày ở phụ lục 1
• Độ tuyến tính
Kết quả khảo sát mức độ tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 50 - 250μg/ml cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ calci rosuvastatin và diện tích pic theo phương trình y = 41175.6935x
+ 20161.2000 với giá trị R2= 0,9999. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện
tích pic và nồng độ calci rosuvastatin được trình bày ở phụ lục 1.
Kết luận: Có thể sử dụng phương pháp HPLC để định lượng calci rosuvastatin trong SNEDDS và viên nang mềm chứa SNEDDS rosuvastatin
b) Phương pháp định lượng dược chất bằng HPLC trong mẫu thử hòa tan
• Độ thích hợp hệ thống
Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn calci rosuvastatin có nồng độ 12µg/ml. Kết quả cho thấy điều kiện sắc ký phù hợp để định lượng calci rosuvsatatin: thời gian lưu 14,936 phút có RSD là 0,034 (%) < 1%,
diện tích pic có RSD là 0,136% < 2%, hệ số kéo đuôi có RSD 0,002% < 2%. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống trình bày ở phụ lục 2.
• Độ đặc hiệu
Kết quả sắc ký cho thấy các mẫu trắng, mẫu placebo không có pic tại thời gian lưu của pic calci rosuvastatin trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thời gian lưu mẫu thử (14,930 phút) tương tự thời gian lưu mẫu chuẩn (14,933 phút). Như vậy phương pháp sắc ký đã chọn có tính đặc hiệu cao. Hình ảnh sắc ký đồ được trình bày ở phụ lục 2
• Độ tuyến tính
Kết quả khảo sát mức độ tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ calci rosuvastatin trong khoảng 3 - 18μg/ml cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ calci rosuvastatin và diện tích pic theo phương trình y = 35952,02x +
1487,13 với giá trị R2= 0,9997. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic
và nồng độ calci rosuvastatin được trình bày ở phụ lục 2.
Kết luận: Có thể sử dụng phương pháp HPLC để định lượng calci rosuvastatin trong mẫu thử hòa tan.
3.1.2. Phương pháp định lượng dược chất bằng đo quang phổ UV-VIS
• Độ thích hợp hệ thống
Tiến hành đo độ hấp thụ lặp lại 6 lần trên một dung dịch chuẩn calci
rosuvastatin có nồng độ 12µg/ml. Kết quả cho thấy RSDđộ hấpthụ < 2,0 % , hệ thống
phù hợp để định lượng calci rosuvastatin trong chế phẩm. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống trình bày ở phụ lục 3.
• Độ đặc hiệu
Kết quả cho thấy: Dung dịch mẫu placebo không hấp thụ tại bước sóng 242
nm. Chứng tỏ tá dược: Capryol 90, Cremophor RH 40, PEG 400, không ảnh hưởng
tới độ hấp thụ quang của calci rosuvastatin ở bước sóng 242nm.
• Độ tuyến tính
Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn calci rosuvastatin với các nồng độ trong khoảng 6 - 18 μg/ml. Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát, nồng độ calci rosuvastatin và độ hấp thụ quang của dung dịch có mối
tương quan tuyến tính theo phương trình y = 0,0406x + 0,01với giá trị R2 = 0,9995. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ quang và nồng độ calci rosuvastatin thể hiện trong phụ lục 3.
Kết luận: Phương pháp đo quang phổ UV - VIS có thể dùng để định lượng calci rosuvastatin xác định tỷ lệ dược chất được nhũ hóa.
3.2. Nghiên cứu bào chế viên nang mềm
3.2.1. Xây dựng công thức vỏ nang
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ gelatin và loại chất hóa dẻo, các yếu tố được giữ cố định gồm gelatin 150 BL (Loại B, nguồn gốc từ da bò), nhiệt độ
hòa tan gelatin 600C, thời gian ủ dịch vỏ nang 14 giờ, nhiệt độ ủ dịch vỏ nang 580C.
Thành phần dịch vỏ nang thể hiện trong bảng 3.1.
3.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ gelatin và loại chất hóa dẻo Bảng 3.1. Tỷ lệ % kl/kl các thành phần trong dịch vỏ nang
Kết quả khảo sát cho thấy: Với tỷ lệ gelatin ở mức 35% và sử dụng chất hóa dẻo glycerin (20%), công thức vỏ nang A1 không tạo được màng vỏ nang. Khi tỷ lệ gelatin được nâng lên 40% trong công thức A2, màng vỏ nang đã có thể tạo được nhưng rất khó bóc màng ra khỏi khuôn, màng mỏng và dễ bị rách. Với tỷ lệ gelatin 43% (công thức A3, A4) thì có thể tạo màng một cách dễ dàng.
Đặc tính của dịch và màng vỏ nang bào chế theo công thức A3, A4 có cùng tỷ lệ gelatin 43% với hai chất hóa dẻo khác nhau ở tỷ lệ 20% được thể hiện trong bảng 3.2.
Thành phần vỏ nang Tên mẫu
A1 A2 A3 A4 Gelatin 35 40 43 43 Dung dịch sorbitol 70% - - - 20 Glycerin 20 20 20 - Methyl paraben 0,09 0,09 0,09 0,09 Propyl paraben 0,01 0,01 0,01 0,01 Nước 44,90 39,90 36,90 36,90
Bảng 3.2. Đặc tính dịch vỏ nang và màng vỏ nang với loại chất hóa dẻo khác nhau (n=3; TB ±SD)
Tiêu chí đánh giá Mẫu A3 Mẫu A4
Thời gian cần làm khô (phút) 140 55
Độ nhớt (cP) 217,0±0,8 177,0±0,1
Độ bền gel (g) 228,8± 0,6 250,6± 0,4
Thời gian cần ủ để dịch trong (giờ) >14 9
Thời gian rã (Phút) 8,1±0,6 13,4±0,7
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Khi sử dụng chất hóa dẻo là glycerin (mẫu
A3), dịch vỏ nang tạo thành có độ nhớt cao hơn, khó phá bọt hơn vì vậy thời gian cần thiết để ủ dịch kéo dài > 14 giờ. Độ bền gel của mẫu A3 cũng thấp hơn so với mẫu A4. Màng vỏ nang mềm thu được có đặc tính dẻo, dễ bóc khỏi khuôn và có thời gian rã ngắn. Tuy nhiên, khi kéo màng mẫu A3 dễ rách.
Khi sử dụng chất hóa dẻo là dung dịch sorbitol (Mẫu A4): Dịch vỏ nang tạo thành có độ nhớt thấp hơn nhưng độ bền gel lại cao hơn so với mẫu A3. Màng vỏ nang thu được có thể chất cứng, rất khó bóc màng ra khỏi khuôn, màng bị dính vào nhau khi bóc, thời gian rã kéo dài hơn mẫu A3. Như vậy mỗi loại chất hóa dẻo đều có ưu, nhược điểm riêng. Để có thể khắc phục nhược điểm của từng loại chất hóa dẻo có thể kết hợp cả glycerin và dung dịch sorbitol trong công thức bào chế dịch vỏ nang.
3.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất hóa dẻo
Giữ cố định tỷ lệ gelatin 43%, chất bảo quản methyl paraben: 0,09%, propyl paraben 0,01%, nước 36,9%, thay đổi tỷ lệ khối lượng các chất hóa dẻo glycerin: dung dịch sorbitol. Kết quả đánh giá màng vỏ nang thể hiện trong hình 3.1; 3.2, bảng 3.3
Bảng 3.3. Đặc tính dịch và màng vỏ nang bào chế với tỷ lệ phối hợp glycerin và dung dịch sorbitol khác nhau (n=6, TB±SD)
Tiêu chí Mẫu vỏ nang
A51 A41 A31 A21 A11 A12 A13 A14 A15
Tỷ lệ Glycerin/ dung dịch sorbitol (kl/kl) 5:1 4:1 3:1 2:1 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 Thời gian ủ đến dịch trong (giờ) >14,5 >14,5 14,5 14 13,5 13 12,5 12 11
Thời gian làm khô
(phút) - - 105 90 75 60 50 - -
Bề dày màng (mm) - - 0,40 ± 0,02 0,40 ± 0,02 0,40± 0,02 0,36± 0,02 0,35± 0,03 - -
Thời gian hòa tan
(phút) - - 40,0±0,5 41,5±0,9 43,0±1,2 44,7±0,8 47,0±0,8 - -
Lực kéo đứt (N) - - 8,9±0,3 9,3±0,6 13,9±0,5 16,3±0,3
không
đứt - -
Khả năng kéo giãn
(%) - -
236,0±13,5 321,3±16,8 453,7±21,7 604,0 ± 36,9
- - -
Hình 3.1. Thời hòa tan màng vỏ nang
Hình 3.2. Lực kéo đứt, khả năng kéo giãn màng vỏ nang
Kết quả đánh giá cho thấy: Khi tỷ lệ glycerin trong hỗn hơp chất hóa dẻo giảm dần và tỷ lệ dung dịch sorbitol tăng dần (theo thứ tự 3:1 , 2:1, 1:1, 1:2, 1:3) thì thời gian hòa tan màng màng vỏ nang và lực kéo đứt, khả năng kéo giãn có xu hướng tăng (hình 3.1 và 3.2); thời gian làm khô màng và thời gian cần thiết để dịch vỏ nang hết bọt khí có xu hướng giảm; khả năng bóc màng khỏi khuôn khó hơn; thể chất màng cứng hơn; bề dày màng sau khi làm khô chênh lệch nhiều và ngược lại.
38 40 42 44 46 48
2:1 1:1 1:2 1:3
Thời gian hòa tan màng vỏ nang (phút)
T ỷ lệ glyc er in : du n g d ịch so rb tol 0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 3:1 2:1 1:1 1:2 K h ả n ăn g k éo giãn (% ) L ực k éo đ ứt (N ) Tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol
Mẫu có tỷ lệ glycerin: dung dịch sorbitol là 5:1 và 4:1 có tỷ lệ glycerin cao nên rất khó phá bọt, sau khi ủ dịch vỏ nang 14 giờ lượng bọt khí trong hai mẫu trên vẫn còn nhiều. Mẫu có tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol là 1:5 và 1:4 có tỷ lệ dung dịch sorbitol cao hơn hẳn nên màng tạo ra mỏng, bị rách và dính vào nhau khi bóc ra khỏi khuôn.
Kết luận: Chọn 5 công thức A31, A21, A11, A12, A13 để đánh giá tương tác với SNEDDS rosuvastatin.
3.2.1.3. Khảo sát tương tác của SNEDDS rosuvastatin với màng vỏ nang
Tiến hành bào chế và đánh giá màng vỏ nang theo phương pháp mô tả ở mục
2.3.2.3. Màng vỏ nang được ngâm trong SNEDDS rosuvastatin đựng trong lọ thủy tinh đậy kín. Các mẫu được bảo quản ở 2 điều kiện: điều kiện thường ở phòng thí
nghiệm (nhiệt độ 20 - 35 oC, độ ẩm tương đối 65 - 85 %) và điều kiện lão hóa cấp
tốc (nhiệt độ 40 ± 2 oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5 %). Kết quả đánh giá thể hiện trong
bảng 3.4
Bảng 3.4. Thời gian hòa tan màng vỏ nang trước và sau khi ngâm trong SNEDDS rosuvastatin (n=6, TB±SD) Tên mẫu Tỷ lệ Glycerin/ dung dịch sorbitol
Thời gian hòa tan (phút)
Ban đầu
Sau khi ngâm trong SNEDDS rosuvastatin ĐK thường ĐK Lão hóa cấp tốc Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 1 tuần Sau 2 tuần
A31 3:1 40,3±0,8 48,0± 2,2 - - -
A21 2:1 41,3±0,9 47,7±1,8 46,7±0,4 49,3±1,5 -
A11 1:1 43,0±0,8 44,7±0,4 43,8±1,4 42,3±1,3 -
A12 1:2 44,0±1,4 43,1±0,9 44,3±0,5 43,3±1,7 -
A13 1:3 46,0±0,8 44,7± 2,4 45,0±1,1 44,0±2,1 -
Ghi chú: (-) tạo màng không tan.
Kết quả nghiên cứu cho thấy: các mẫu màng vỏ nang có tỷ lệ glycerin lớn hơn sorbitol (tỷ lệ 3:1, 2:1) sau khi ngâm trong SNEDDS rosuvastatin trở nên khó tan hơn, thời gian hòa tan vỏ nang kéo dài hơn so với ban đầu. Các mẫu màng vỏ
nang có tỷ lệ glycerin ≤ dung dịch sorbitol (tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:3) sau 1 tuần và 2 tuần thời gian hòa tan vỏ nang hầu như không thay đổi so với ban đầu. Ở điều kiện lão hóa cấp tốc thời gian hòa tan màng vỏ nang có xu hướng bị kéo dài ở tất cả các mẫu, sau 02 tuần các màng đều không hòa tan được. Tuy nhiên đây cũng là điều kiện bảo quản không thích hợp đối với viên nang mềm.
Từ kết quả nghiên cứu thu được, tỷ lệ các chất hóa dẻo glycerin:dung dịch sorbitol được chọn là 1:1, 1:2 và 1:3 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của loại gelatin
Tiến hành bào chế và đánh giá màng vỏ nang với 3 công thức được chọn ở trên với 3 loại gelatin khác nhau: G1(Loại A-210 Bloom, nguồn gốc từ da bò), G2 (Loại A/B, 150 Bloom, nguồn gốc từ hỗn hợp da, xương bò và lợn), G3 (Loại B, 150 Bloom, nguồn gốc từ da bò). Các mẫu màng vỏ nang ngâm trong SNEDDS rosuvastatin, bảo quản ở 2 điều kiện: điều kiện thường ở phòng thí nghiệm (nhiệt độ
20 - 35 oC, độ ẩm tương đối 65 – 85 %) và điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ±
2 oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5 %). Kết quả đánh giá đặc tính của dịch vỏ nang, màng
vỏ nang và tương tác giữa SNEDDS rosuvastatin đóng nang và vỏ nang được thể hiện ở bảng 3.5, 3.6 và hình 3.3; 3.4
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của SNEDDS rosuvastatin đến thời gian hòa tan màng vỏ nang từ các nguồn gelatin khác nhau (n= 6, TB±SD)
Loại gelatin
Thời gian hòa tan màng vỏ nang ( phút)
Ban đầu Sau tiếp xúc SNEDD
Phòng thí nghiệm Lão hóa cấp tốc
1 tuần 2 tuần 1 tuần
Tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol là 1:1 G1 38,0±0,8 37,6 ± 0,4 38,4±0,9 - G2 43,0±0,8 44,7±0,4 43,8±1,4 42,3± 1,2 G3 42,3±1,7 43,3 ± 1,3 42,0±0,8 42,6± 1,2 Tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol là 1:2 G1 40,7 ±0,8 40,5± 0,7 40,7±1,0 - G2 43,0±1,6 41,6±0,9 41,3±1,7 41,3±1,7
G3 44,7±0,4 44,8±1,3 44,5±1,2 44,4±1,0
Tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol là 1:3
G1 42,5±0,4 42,8± 1,3 42,5±0,4 -
G2 45,0±0,8 44,7± 1,8 44,0±1,2 42,0±2,2
G3 46,6±0,9 45,2± 1,5 45,3±1,8 46,3±1,3
Ghi chú: (-) tạo màng mỏng không tan.
Theo kết quả bảng 3.5 cho thấy: sau thời gian 1 đến 2 tuần bảo quản ở điều kiện thường, thời gian hòa tan màng vỏ nang bào chế từ 3 loại gelatin theo 3 công thức khác nhau hầu như không thay đổi. Ở điều kiện lão hóa cấp tốc các mẫu màng vỏ nang bào chế từ gelatin G1 tạo màng mỏng không tan ngay sau 1 tuần, trong khi đó mẫu G2 và G3 sau 1 tuần thời gian hòa tan của màng vỏ nang hầu như không biến đổi so với ban đầu.
Bảng 3.6. Tính chất của dịch vỏ và màng vỏ nang với 3 loại gelatin (n=3, TB±SD)
Tiêu chí G1 G2 G3
Tỷ lệ glycerin:dung dịch sorbitol là 1:1
Thời gian hòa tan gelatin (giờ) 1,5 3h 2,5h
Độ bền gel (g) 385,1±0,1 285,4±0,3 286,2±0,3
Độ nhớt (cP) 125,0±0,2 174,2±0,2 144,0±0,1
Độ dày màng (mm) 0,35±0,02 0,40±0,03 0,35±0,02
Thời gian hòa tan màng (phút) 38,0±0,5 43,0±0,8 42,3±1,7
Hình 3.3. Đặc tính dịch vỏ nang bào chế với các loại gelatin khác nhau
Có thể thấy: độ bền gel dịch vỏ nang hoàn toàn phù hợp với đặc tính nguyên liệu gelatin sử dụng. Mẫu G1 có độ bền gel lớn nhất, các mẫu G2 và G3 có độ bền gel khác nhau không đáng kể. Dịch vỏ nang bào chế với gelatin G2 và G3 có độ nhớt cao hơn mẫu G1 nên thời gian hòa tan gelatin và thời gian ủ dịch cũng phải kéo dài hơn.
Hình 3.4. Đặc tính màng vỏ nang bào chế với các loại gelatin khác nhau Nhận xét: Cả ba mẫu màng vỏ nang có bề dày màng sau khi làm khô tương đối đồng đều, trong đó mẫu G3 độ bền cơ học tốt hơn cả (lực kéo đứt lớn nhất).
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 13 13.5 14 14.5 15 G1 G2 G3 Độ dày m àng (m m ) Lực kéo đứt (N) Loại gelatin Lực kéo đứt Độ dày màng
Từ kết quả nghiên cứu thu được, gelatin G3 (Loại B, 150 Bloom, nguồn gốc từ da bò) được chọn để đưa vào công thức bào chế dịch vỏ nang.
3.2.1.5. Ảnh hưởng của thành phần vỏ nang đến khả năng hàn kín viên nang
Tiến hành bào chế viên nang mềm sử dụng loại gelatin G3 theo 3 công thức dịch vỏ nang với tỷ lệ chất hoá dẻo là glycerin: dung dịch sorbitol là 1:1 (A11), 1:2 (A12) và 1:3 (A13). Dịch thuốc đóng nang là SNEDDS rosuvastatin. Tiến hành hàn vỏ nang ở các nhiệt độ khác nhau, đánh giá độ kín mép hàn của viên nang bằng cách bóp nhẹ viên, nếu thấy có dịch chảy ra chứng tỏ mép hàn không kín. Kết quả được trình bày tại bảng 3.7
Bảng 3.7. Ảnh hưởng thành phần vỏ nang đến nhiệt độ hàn vỏ
Nhiệt độ hàn Tên mẫu
A11 A12 A13
39oC - - -
40oC + + -
41oC - + ±
42oC - - +
(+): Viên được hàn kín, không bị rò rỉ dịch khi bóp nhẹ viên và làm khô