- Phương pháp mô tả triệu chứng bệnh và đặc điểm bào tử
+ Triệu chứng bệnh
Chọn cây có triệu chứng bệnh, thể hiện về mặt hình thái rõ và đại diện nhất. Quan sát triệu chứng bằng mắt thường, kính lúp hoặc kính soi nổi, mô tả các đặc điểm bên ngoài của ngọn, thân, lá, rễ bị bệnh như biến đổi về màu sắc, bệnh trạng, sự phân bố bệnh trạng trên ngọn, thân, lá, rễ. Mô tả và chụp ảnh cây bị bệnh.
+ Đặc điểm bào tử
Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái bào tử được quan sát trên kính hiển vi Olympus BX50 độ phóng đại 2000 lần về hình dáng, kích thước, màu sắc, thể bám.
- Phương pháp phân lập nấm gây bệnh và đặc điểm của hệ sợi nấm
+ Phân lập nấm gây bệnh
Đối với phân lập nấm bệnh hại rễ ta tiến hành làm bẫy nhử như sau: Cho rễ có triệu chứng bị bệnh vào trong khay, đổ nước cất ngập rễ khoảng 10 - 15cm, vớt sạch váng, bẩn nổi trên bề mặt nước. Sau 6 - 8 giờ thả lá non, tươi của các loài cây mẫn cảm với nấm gây bệnh như: lá cây họ đậu, lá dẻ, cà ổi, lá đỗ quyên..., các vật liệu bẫy sẽ nổi trên mặt nước. Sau 2-4 ngày trên lá sẽ xuất hiện nhiều đốm đen đó là triệu trứng lá bị nhiễm nấm bệnh, chọn những lá đó tiến hành phân lập. Trước tiên khử trùng bề mặt lá bệnh, cắt phần lá biểu hiện bệnh thành các miếng nhỏ, chú ý lấy phần đốm đen sát ranh giới giữa phần bị bệnh và không bệnh của lá, rồi đặt vào hộp lồng chứa môi trường CMA (corn meal agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml; Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol 0.05g))/lít), băng kín và theo dõi trong tủ định ôn 250C, sau 3-5 ngày các sợi nấm xuất hiện tiến hành tách và
cấy truyền đến khi được sợi nấm thuần khiết Agros G.N. (2005); Burgess et
al. (2009); Phạm Quang Thu et al., (2010); Phạm Quang Thu et al., (2013). + Nghiên cứu đặc điểm hệ sợi nấm
Nuôi cấy sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng PDA sau đó đo kích thước và chụp ảnh hệ sợi, thể quả, các dạng bào tử vô tính hữu tính, mô tả hình thái màu sắc. Đặc điểm của hệ sợi được quan sát trên kính hiển vi Olympus BX50 độ phóng đại 2000 lần.
- Phương pháp giám định nấm gây bệnh bằng đặc điểm hình thái và bằng sinh học phân
+ Giám định bằng đặc điểm hình thái
Giám định nấm gây bệnh bằng đặc điểm hình thái là phương pháp dựa trên những triệu chứng bệnh đã được mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát được trên kính hiển vi, hình dáng, kích thước, màu sắc. Giám định nấm bệnh dựa trên khóa định loại và mô tả loài theo khóa định loại loài nấm gây bệnh dựa theo tài liệu chuyên khảo về nấm, đặc biệt các chuyên khảo về Phytopthora của Waterhouse & Waterston (1966); Phytophthora spp. của
Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987).
- Giám định nấm gây bệnh bằng sinh học phân tử
+ Phương pháp giám định bằng sinh học phân tử đối với một số bệnh hại chính
Tách ADN: Tách ADN của nấm sử dụng phương pháp glassmilk, cho
một lượng nhỏ sợi nấm vào ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm vào đó khoảng 200-250 µl extraction buffer (Reader và Broda, 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 650C trong 90 phút. Sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phút. Hút 200 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong có chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 12 µl
glassmilk. Hỗn hợp được ủ lạnh trong vòng 15 phút để ADN gắn vào glassmilk (chú ý lắc thường xuyên), sau đó được ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch wash buffer và cồn tuyệt đối. Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan trong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 450C trong vòng 15 phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14000 vòng/phút từ 1- 2 phút, phần hỗn hợp chứa ADN được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 40C
Phản ứng PCR: Vùng ITS 1 và 2 được phản ứng từ ADN vừa thu trên
bằng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gen ITS1-F của nấm và ITS4 (Gardes và Bruns, 1993). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl ADN được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 µM MgCl2, 0.25 µM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH+ polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số phản ứng PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi ADN ở 950C trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi ADN ở 940C trong 30 giây, giai đoạn nhân bản ở nhiệt độ 550C trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được thực hiện ở 720C trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler.
Điện di: Các sản phẩm PCR được điện di trên bản gel (1% agarose) ở
100volts/cm, trong 30 phút. Thang ADN 100bp (Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kích cỡ ADN. Bản gel được nhuộm trong Red safe, lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. ADN được quan sát dưới tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Reader UV.
Định tên vi sinh vật bằng giải trình tự
Phân đoạn rADN của vi sinh vật được khuyếch đại trên thiết bị C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-Rad, Mỹ) với chương trình nhiệt được thiết lập
với pha biến tính ở 94°C trong 3 phút kế tiếp là 30 chu kỳ nhiệt (94°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút). Quá trình khuyếch đại được hoàn tất ở 72°C trong 10 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 10 °C.
Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại được tinh chế bằng Silica beadDNA gel extraction (Thermo, Mỹ) theo khuyến cáo của hãng. Trình tự ADN được đọc bằng phương pháp “dideoxy chain termination” với việc sử dụng kit BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Standard (Thermo, Mỹ) theo hướng dẫn của hãng. Máy đọc trình tự, model 3500Genetic analyzer của hãng Thermo được sử dụng. Các chuỗi ADN được so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank thông qua giao diện tìm kiếm giao diện tìm kiếm BLAST nucleotide-nucleotide đặt tại National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Mỹ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov hoặc http://www.ezbiocloud.net/. Các chuỗi liên quan được chuyển tải về sau đó xử lý bằng phần mềm BioEdit (Hall, 1999).
- Gây bệnh nhân tạo đối với cây Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm Đánh giá tính gây bệnh của chủng nấm phân lập được thông qua gây bệnh nhân tạo đối với cây con ngoài vườn ươm theo phương pháp lây bệnh nhân tạo vào đất trên môi trường hạt kê vỏ trấu (Lester et al., 2009). Thí
nghiệm được tiến hành với 2 công thức: CT1 gây bệnh nhân tạo đối với chủng nấm TN; Công thức 2 (ĐC) mỗi công thức 30 cây 3 lần lặp tại vườn ươm của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam (Phường Đức Thắng, Quận Bắc Từ Liêm, Hà Nội). Theo dõi thí nghiệm trong vòng 30 ngày sau đánh giá tỷ lệ bị hại và mức độ bị hại.