Đối với vườn ươm:
Tiến hành điều tra bệnh chết héo Keo tai tượng tại 3 địa điểm Xã Đông Đạt, xã Ôn Lương, xã Yên Ninh huyện Phú Lương. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Tỷ lệ bệnh và cấp bệnh của Keo tai tượng tại vườn ươm tại huyện Phú Lương
STT Địa điểm điều tra Tỷ lệ bị bệnh trung bình (%) Cấp bệnh trung bình Pkv Rkv 1 Xã Động Đạt - Phú Lương 22,8 0,52
2 Xã Ôn Lương - Phú Lương 20,1 0,24
3 Xã Yên Ninh - Phú Lương 19,7 0,18
Qua bảng số liệu ở bảng 3.1 cho thấy, tại vườn ươm Keo tai tượng nằm trên địa bàn 3 xã huyện Phú Lương đều xuất hiện tình trạng cây con bị chết héo. Xã Động Đạt huyện Phú Lương có tỷ lệ bị bệnh cao nhất, đạt 22,8%, cấp bệnh là 0,52. Các cây con bị bệnh: thân và lá héo, không có khả năng sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất kém.
Đối với rừng trồng:
Tiến hành lập ô tiêu chuẩn 500m2 điều tra đo đếm cây Keo tai tượng bị bệnh chết héo trên địa bàn huyện Phú Lương tỉnh Thái Nguyên. Các ô tiêu chuẩn được lập trên 3 xã Động Đạt, Ôn Lương, Yên Ninh, đây đều là các xã có diện tích trồng Keo tai tượng lớn của huyện và đã xuất hiện bệnh chết héo.
Bảng 3.2: Tỷ lệ bị bệnh và cấp bệnh của Keo tai tượng tại huyện Phú Lương
STT Địa điểm điều tra Tỷ lệ bị bệnh trung bình (%) Cấp bệnh trung bình Pkv Rkv 1 Xã Động Đạt - Phú Lương 27,2 0,72
2 Xã Ôn Lương – Phú Lương 23,8 0,64
3 Xã Yên Ninh – Phú Lương 21,7 0,52
Qua bảng số liệu 3.2 cho thấy, Các ô tiêu chuẩn được lập trên địa bàn 3 xã Động Đạt, Ôn Lương, Yên Ninh đều xuất hiện hiện tượng cây Keo tai tượng bị chết héo. Trong đó xã Động Đạt cho thấy tỷ lệ bị bệnh và cấp bệnh cao nhất đạt P= 27,2% và R= 0,72. Hầu hết những cây bị bệnh đều có triệu chứng điển hình như : tán lá héo, lá rụng, chết.
Hình 3.2: Keo tai tượng bị bệnh chết héo 3.1.2. Xác định nguyên nhân gây bệnh
Cây Keo tai tượng bị bệnh ban đầu lá có màu xanh nhưng sau dần dần héo. Thân héo khô ngay sau giai đoạn tán lá bị héo, lá bắt đầu rụng. Bệnh gây ra do rễ cây bị nhiễm nấm bệnh, rễ cây bị thối, do đó làm hạn chế hoặc không có khả năng hấp thu nước và chất dinh dưỡng nuôi cây, dẫn đến lá cây bị héo dần và chết. Thân cây ban đầu vẫn còn tươi và nhẵn sau chuyển sang héo khô lại. Khi đào bộ rễ keo tai tượng thấy rễ cây dễ bị đứt, rễ có màu nâu sậm, phía bên ngoài vỏ rễ một số phần đã bị thối nhũn.
Hình 3.3 Cây Keo tai tượng bị bệnh
Phận lập các mẫu đất và rễ thu thập từ các cây Keo tai tượng bị bệnh bằng phương pháp bẫy nấm thu được chủng nấm gây bệnh.
Hình 3.4: Phân lập nấm bệnh bằng phương pháp bẫy nấm
Từ các vị trí bệnh trên lá, tiến hành phân lập trên môi trường nuôi cấy chuyên dụng. Sau 3 ngày phân lập, đĩa thạch xuất hiện
Hình 3.5: Nấm gây bệnh phân lập được
Hệ sợi trên môi trường dinh dưỡng hình thành nhiều u nhỏ, độ dày lên đến 8 μm, hệ sợi nổi lên thành các bó cụm, điển hình là hình cầu, với đường kính trung bình từ 42 μm. Nét đặc trưng của hệ sợi là có dạng san hô, không có vách ngăn. Trong nuôi cấy thuần khiết, hệ sợi nấm hình thành nhiều bào tử vách dày (chlamydospore). Bào tử vách dày hình cầu có kích thước từ 28- 35μm (hình 3.6). Túi bào tử động (sporangia) hình elip đến hình trứng, có kích thước 57x33 μm (nhiều lúc kích thước lên tới 100 x 40 μm), không có núm (non-papilate), hơi dày lên ở đỉnh (hình 3.7). Bào tử noãn (oogonia) không xuất hiện trên cùng một loại hệ sợi chứng tỏ nấm thuộc nhóm dị tản (heterothallic). Túi noãn (oogonium) có đường kính trung bình 40 μm, vách nhẵn. Túi đực (antheridium) có kích thước 21-23x17 μm (hình 3.8). Túi bào tử động trưởng thành bắt đầu phóng bào tử động (zoospore), bào tử động có 2 lông roi ở hai đầu có kích thước nhỏ 7-10μm (hình 3.9). Bào tử động chuyển sang giai đoạn bào nang (encysted zoospore) và nảy mầm, bào nang có kích thước từ 8-14 μm (hình 3.9).
Hình 3.6: Hệ sợi nấm có cấu tạo dạng san hô Hình 3.7: Bào tử vách dày (chlamydospores) Hình 3.8: Túi bào tửđộng (sporangia)
Hình 3.9: Bào tử noãn (oogonia)
Hình 3.10: Túi bào tửđộng phóng bào tửđộng (zoospore)
Đối chiếu với mô tả của Waterhouse&Waterston (1966) và chuyên khảo về Phytophthora spp. của Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987), nấm bệnh
phân lập được được xác định là loài nấm Phytophthora cinnamomi thuộc chi Phytophthora, họ Pythiaceae, bộ Pythiales, lớp Oomycetes. Đây là loài nấm lần đầu tiên được ghi nhận gây hại Keo tai tượng ở Việt Nam.
- Giám định nấm gây bệnh bằng đặc điểm hình thái và bằng sinh học phân tử
Chọn chủng TN có khả năng gây bệnh mạnh nhất tiến hành giám định theo phương pháp sinh học phân tử bằng so sánh trình tự ITS trong 28 rRNA So sánh trình tự đoạn ITS của chủng TN với trình tự của nấm Phytophthora
cinnamomi đã công bố cho thấy có độ tương đồng 478/478(100%).
- Gây bệnh nhân tạo đối với cây Keo tai tượng trong giai đoạn vườn ươm Đánh giá tính gây bệnh của chủng nấm phân lập được thông qua gây bệnh nhân tạo đối với cây con ngoài vườn ươm kết quả được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả gây bệnh nhân tạo của các chủng nấm
TT Công thức (chủng nấm)
Sau 15 ngày Sau 30 ngày
P1(%) R1 P2(%) R2
1 Chủng TN 76,4 2,1 93,5 3,2
2 Đối chứng 0 0 0 0
Qua số liệu bảng 3.3 cho thấy kết quả thí nghiệm cho thấy chủng nấm TN phân lập được sử dụng gây bệnh nhân tạo có khả năng gây bệnh chết héo trên cây Keo tai tượng 3 tháng tuổi khi được thí nghiệm gây bệnh nhân tạo ở ngoài vườn ươm. Sau 15 ngày gây bệnh nhân tạo tỷ lệ bị bệnh của là 76,4% và cấp bị bệnh từ là 2,1. Sau 30 ngày gây bệnh nhân tạo tỷ lệ bị bệnh của nấm gây bệnh là 93,5%. Các triệu chứng biểu hiện khi gây bệnh nhân tạo ngoài vườn ươm giống với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên. Tiến hành
phân lập lại từ những cây thí nghiệm có triệu chứng bệnh kết quả thu được nấm bệnh có đặc điểm bào tử và hệ sợi như đã phân lập ban đầu. Từ kết quả này một lần nữa xác định bệnh chết héo là bệnh hại chính để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh
Ảnh hưởng của nhiệt độđến sinh trưởng của hệ sợi nấm
Nhiệt độ không khí ảnh hưởng rất lớn đến sự nảy mầm của bào tử, xâm nhiễm, lan truyền cũng như sinh trưởng và phát triển của sợi nấm. Đặc biệt nhiệt độ quyết định thời gian nhiễm bệnh, ủ bệnh và phát bệnh của nấm. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của sợi nấm có ý nghĩa rất lớn trong việc tìm hiểu sự xâm nhiễm, lây lan vào thời kỳ phát bệnh. Trên cơ sở đó thực hiện công tác dự báo ngắn hạn, dài hạn để xây dựng kế hoạch quản lý dịch bệnh hại ở khu vực. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm được tiến hành với 6 thang nhiệt độ khác nhau (150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C) mỗi thí nghiệm 5 hộp lồng 3 lần lặp. Sinh trưởng của hệ sợi nấm được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độđến sinh trưởng của hệ sợi nấm Thời
gian
Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
Fpr Lsd 150C 200C 250C 300C 350C 400C
1 ngày 23b 27e 27e 26d 22a 25c <.001 0.5728
2 ngày 41b 46e 49f 38a 43c 45d <.001 0.5959
3 ngày 89c 105d 115e 105d 87b 85a <.001 0.915
Số liệu ở bảng 3.4 cho thấy sinh trưởng của hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau thì sinh trưởng khác nhau. Hệ sợi nấm sinh trưởng phát triển được trên môi trường nuôi cấy thuần khiết trong khoảng nhiệt độ không khí từ 150C - 350C, khoảng nhiệt độ thích hợp là 200C - 300C trong đó nhiệt độ thích
hợp nhất là 250C hệ sợi sinh trưởng phát triển tốt, tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhiễm và sinh trưởng phát triển vào cơ thể cây chủ. Nhiệt độ không khí lớn hơn 350C-400C hệ sợi nấm vẫn phát triển bình thường (hình 3.12). Vậy nấm gây bênh có khả năng sinh trưởng và phát triển trên biên độ nhiệt rộng khi gặp điều kiện thuận lợi nấm bệnh bùng phát thành dịch.
150C 200C 250C
300C 350C 400C
Hình 3.12: Sinh trưởng của hệ sợi nấm Phytophthora Phytophthora
cinnamomi ở các thang nhiệt độ khác nhau
Ảnh hưởng độẩm không khí đến sinh trưởng của sợi nấm
Độ ẩm là một trong những nhân tố quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của nấm. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng của nấm bệnh có vai trò trong việc tìm hiểu quá trình phát sinh và phát triển của bệnh. Đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng của hệ sợi nấm được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của ẩm độ đến sinh trưởng của hệ sợi nấm Thời
gian
Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm) Fpr Lsd
60% 70% 80% 90% 100%
1 ngày 24a 26c 27d 28e 25b <.001 0.626 2 ngày 65c 60a 62b 67d 65c <.001 0.849 3 ngày 87a 95b 97d 103e 96c <.001 0.755
Qua số liệu bảng 3.5 nhận thấy nấm sinh trưởng tốt ở ẩm độ không khí trong khoảng từ 80% - 95%. Độ ẩm thích hợp nhất cho hệ sợi nấm phát triển là 95% tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nấm nảy mầm, xâm nhập và sinh trưởng phát triển trong cơ thể cây chủ. Ở độ ẩm không khí nhỏ hơn 80% và lớn hơn 90% nấm phát triển bình thường (hình 3.18). Vậy chứng tỏ nấm gây bệnh có khả năng sinh trưởng và thích nghi ở các độ ẩm khác nhau cho nên loại nấm này dễ dàng gây bệnh vào các mùa trong năm. Khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi như (ẩm độ, nhiệt độ không khí phù hợp) nấm dễ bùng phát và gây thành dịch. Hệ sợi nấm sinh trưởng rất nhanh trong khoảng 40 giờ nấm phát triển kín hộp lồng (hình 3. 13)