4. Điểm mới của đề tài
1.3.3. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
* Khái quát Realtime PCR: Real time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch
đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuyếch đại xảy ra để có thể đọc được sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Sự phát hiện sản phẩm PCR sẽ dựa vào cường độ huỳnh quang của bình phản ứng. Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ nhiệt và tỷ lệ thuận với sản phẩm được nhân bản.
Cường độ phát huỳnh phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền nên không thể phát hiện được sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng (Phạm Hùng Vân, 2008) (Nguyễn Văn Cảm, 2005).
* Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT–PCR)
- Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT–PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Realtime, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct(Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Virus cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → cDNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT–PCR.
- Nguyên lí hoạt động của probe
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe.
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.