Phòng bệnh bằng vaccine

4. Điểm mới của đề tài

1.4.2. Phòng bệnh bằng vaccine

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người.

Sau các đợt dịch cúm gia cầm 1958 - 1959 và 1968 - 1969 ở Mỹ cũng như tại nhiều nơi trên thế giới người ta đã dùng nhiều loại thuốc trong đó có kháng sinh để điều trị bệnh nhằm hạn chế sự lây lan và sô lượng tử vong do cúm gia cầm gây ra.

Năm 1970 Lang GO và cộng sự đã dùng Adamantadin để điều trị bệnh cúm gia cầm ở gà Tây cho kết quả khá tốt, chữa khỏi được bệnh trên 60% gà bệnh (Lê Văn Năm, 2004).

Năm 1984 Beard và 1985 Webster đã lập lại việc điều trị bệnh cúm gà bằng

Adamatadin kết hợp với Rimantadin và đã giảm 50% tỷ lệ gà chết so với lô đối chứng (Beard và cs, 1984; Wu và cs, 2008)

Năm 2004 Nhật Bản đã giới thiệu một loại thuốc Anti - flu có thể điều trị được bệnh cúm gia cầm (Lê Văn Năm, 2004).

Việc sử dụng các thuốc trên tuy có làm giảm tỷ lệ chết nhưng không thay đổi tỷ lệ nhiễm và gia cầm vẫn tiếp tục bài thải virus. Hiện nay đã có các loại thuốc chống cúm mới nhất là những loại có tác dụng ức chế neuraminidase như Tamiflu hay Zanamivir nhưng vẫn bị kháng thuốc tương đối nhiều và còn có nhiều tác dụng phụ (Vũ Thị Mỹ Hạnh và cs, 2008)

Ưu nhược điểm khi sử dụng vaccine phòng cúm gia cầm (Vũ Thị Mỹ Hạnh và cs, 2008).

- Tạo được kháng thể cho cúm gia cầm, có tác dụng làm giảm số nhiễm và số chết nhờ việc làm giảm tình trạng mẫn cảm của gia cầm với chủng virus gây bệnh.

- Giảm bài thải virus 1000 lần so với gia cầm không tiêm và ngừng hẳn sự bài thải virus sau 13 - 18 ngày tiêm phòng, nhờ vậy làm giảm khả năng lây truyền bệnh.

- Giảm thiểu việc loại thải những đàn gia cầm khỏe mạnh, giảm thiệt hại về kinh tế cho chăn nuôi gia cầm công nghiệp.

Một số hạn chế gặp phải đó là:

- Hiệu lực và độ dài miễn dịch chưa được nghiên cứu đầy đủ. - Có thể gây trở ngại cho chẩn đoán huyết thanh học.

- Do thời gian nung bệnh của cúm gia cầm ngắn (1 - 3 ngày) nên việc sử dụng vaccine khó đạt được hiệu quả khi dùng trong các ổ dịch.

Một số loại vaccine được ghi nhận hiện nay (Lê Văn Năm, 2004):

- Vaccine đồng chủng (Homologous): Đây là loại vaccine vô hoạt có cùng kháng nguyên H và N với virus gây bệnh ngoài thực địa, nên có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt chống lại virus gây bệnh cường độc và đã được sử dụng ở Pakistan, Mehico và Mỹ

Hạn chế của loại vavcine này là không loại bỏ được tận gốc sự lây nhiễm virus cúm tức là không loại trừ được khả năng thâm nhập virus cường độc vào cơ thể gà. Nếu sử dụng vaccine loại này thì trình độ khoa học thế giới ngày nay chưa đủ để phân biệt rõ đàn gia cầm nào đã được tiêm phòng và chưa được tiêm vaccine... Đây là một trở ngại lớn nhất, là nguyên nhân dẫn đến sự lúng túng, do dự và trì trệ trong việc quyết đoán giải pháp cần lựa chọn mà hậu quả dẫn đên khôn lường: bệnh nhanh chóng trở thành dịch có xu thế thành đại dịch, tạo điều kiện thuận lợi cho việc biến chủng và tăng tính độc lực của virus cúm.

- Vaccine dị chủng: Đây cũng là một vaccine vô hoạt có cùng thành phần kháng

nguyên H nhưng kháng nguyên N khác với virus gây bệnh cúm thực địa. Ưu điểm nổi bật của loại vaccine này là cho phép chúng ta có thể phân biệt được đàn gia cầm chưa tiêm và đã được tiêm vaccine.

Tuy nhiên muốn làm được điểu này chúng ta phải có cả một ngân hàng vaccine đủ chủng loại, đủ cơ số để sử dụng ngay trong trường hợp khẩn cấp. Đồng thời phải có một hệ thống y tế dự phòng đủ mạnh để kiểm soát dịch.

- Vaccine tái tổ hợp: Đây là loại vaccine được chế tạo theo công nghệ gen trên cơ

sở nguyên tắc của vaccine dị chủng. Tức là có kháng nguyên H tương đồng với kháng nguyên H của virus thực địa, nhưng kháng nguyên N lại khác căn bản với kháng nguyên N của virus cường độc.

* Tình hình sử dụng vaccine trên thế giới và khuyến cáo OIE

Các nhà khoa học của tổ chức OIE, WHO... đã khuyến cáo các nước có cúm gia cầm như sau:

- Sử dụng vaccine vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ là một giải pháp hỗ trợ để dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch và vaccine chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại bỏ được tận gốc bệnh cúm.

- Chỉ tiêm phòng vaccine khi thật khẩn cấp.

Phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm có độc lực cao (HPAI) hay có độc lực thấp (LPAI).

Phải có ngân hàng vaccine đủ các chủng loại kháng nguyên H và N nhằm hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng.

Phải có hệ thống kiểm soát thú y chặt chẽ từ trung ương đến địa phương nhằm kiểm soát những đàn đã sử dụng vaccine với những đàn chưa sử dụng vaccine.

Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việc tiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để. Tuy nhiên với những nỗ lực của ngành từ những năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án thử nghiệm và khảo nghiệm vaccine cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan (Nguyễn Tùng và cs, 2011).

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu

+ Gia cầm sống buôn bán tại chợ và các trang trại chăn nuôi trên địa bàn huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình.

+ Vịt nuôi tại huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình. + Vaccine QB7412.

- Phạm vi nghiên cứu

+ Thời gian nghiên cứu: 6 tháng, từ tháng 8/2017 đến tháng 01/2018. + Đề tài được thực hiện tại Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình.

+ Địa điểm lấy mẫu giám sát: chợ và các trang trại tại huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình.

- Thử nghiệm hiệu lực vaccine QB7412 ở trang trại chăn nuôi gia cầm tại Công ty TNHH TM&DV Hoàng Hải, xã Thanh Thủy, huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình.

- Xét nghiệm mẫu swab tại Phân viện Thú y Miền Trung và mẫu huyết thanh được thực hiện tại Viện Thú y Quốc Gia.

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Điều tra tình hình chăn nuôi gia cầm giai đoạn 2013-2017.

- Xác định một số yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch cúm gia cầm tại huyện Lệ Thủy, Quảng Bình.

- Khảo sát sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 trên địa huyện Lệ Thủy, Quảng Bình. - Đánh giá đáp ứng miễn dịch của vịt đối vớivaccine QB7412.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Xác định sự lưu hành virus cúm A bằng phương pháp Realtime RT-PCR

- Phương pháp lấy mẫu: Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển được thực hiện theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-83:2011/BNNPTNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật- yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm bảo quản và vận chuyển.

+ Lấy dịch hầu họng (swab): Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy, thu dịch nhầy sau đó từ từ rút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản mẫu bằng đệm PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline), bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về Phân viện thú y Miền Trung để tiến hành xét nghiệm.

Mẫu swab gộp được bảo quản trong dung dịch chứa trong các ống chuyên đựng mẫu swab. Trộn xốc ống mẫu vẫn còn tăm bông bên trong 15 giây sau đó ly tâm ống ở 1000g trong 10 phút và thu dung dịch nổi vào các ống Eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống Eppendorf.

Sau khi xử lí mẫu, các ống Eppendorf được tiến hành tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu được mang ra rã đông.

+ Lấy mẫu huyết thanh: lấy máu ở tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch chân. Trước khi lấy máu cắt lông trên khu vực cần lấy, sát trùng bằng cồn Ethanol 70% rồi dùng kim tiêm vô trùng lấy từ 1ml đến 5ml máu. Máu lấy ra được chứa trong bơm tiêm, rút pit tong tạo khoảng trống, ký hiệu mẫu rồi để nghiêng ống nghiệm rồi đặt nghiêng 45o trong hộp đựng mẫu, để trong 1 đến 2 giờ ở nhiệt độ thường tránh ánh nắng, rồi sau đó chắt huyết thanh sang ống Eppendorf và ghi ký hiệu lên ống. Nếu không sử dụng huyết thanh ngay thì bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở -20oC cho đến khi thực hiện phản ứng.

- Thực hiện thu mẫu swab tại chợ, trang trại chăn nuôi: mẫu được lấy ngẫu nhiên từ các hộ buôn bán gia cầm sống, các trang trại chăn nuôi gia cầm trên địa bàn huyện Lệ Thủy định kỳ đầu tuần thứ 3 của tháng lấy 4 mẫu gộp/1 đợt/tháng trong vòng 6 tháng, với tổng số mẫu lấy được là 24 mẫu gộp tương đương với 240 mẫu đơn và được gộp ngay tại nơi lấy mẫu, ký hiệu mẫu theo tên huyện - số thứ tự (ví dụ: LT - 01).

* Thiết bị và dụng cụ

- Tủ lạnh âm -20oC, -80oC; tủ lạnh thường 2- 8oC. - Tủ ấm 37oC.

- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.

- Máy ly tâm lạnh ống Eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.

- Máy Realtime PCR Biorad.

- Bộ micropipet các cỡ, ống Eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.

- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).

- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...

- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).

* Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm:

- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH.

- Nước dùng cho phản ứng sinh học phân tử không có Rnase.

- Ethanol tuyệt đối.

- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT

- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).

- MgCl2 (Promega) 25mM.

Bảng 2.1: Danh sách Primer & Prober

PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix

Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1

Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None

Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None

H5-9S

Probe FAMTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 FAM BHQ1

Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None

Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None

Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None

N1-2 China

Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1

Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None

Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None

N6-1

Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1 FAM BHQ1

Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None

Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None

H7-6 Coda

Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG -BHQ1-

3’

FAM BHQ1

Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None

Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None

N9-1 CNIC Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC - BHQ1-3’ FAM BHQ1

Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None

* Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR xác định lượng

virus cúm gia cầm

- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).

- RNA đối chứng dương tính M, H5 của virus cúm A/H5N1, A/H5N6. - Hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) và probe (mẫu dò).

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.

- Các nucleotide tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch đệm, Mg2+...

* Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR

- Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số

+ Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Hút pha nước phía trên sang ống Eppendorf mới có đánh ký hiệu mẫu.

+ Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở âm 700C.

- Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNR Mini

+ Cho 500l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA. + Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây.

+ Ủ ở nhiệt độ phòng (15-20oC) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.

+ Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh. + Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.

+ Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.

+ Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 20oC trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 70oC trong thời gian dài.

- Chuẩn bị hỗn hợp nhân gene (master mix)

Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống Eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào ống Eppendorf các thành phần với lượng như sau (bảng 2.1)

Bảng 2.2. Thành phần của master mix

TT Nguyên liệu Lượng (µl)

1 DW 4,3

2 2X ReactionBuffer 7,5

PPP

Primer forward (40uM)

0,9 Primer reverse (40uM)

Probe (10uM)

3 Enzyme mix 0,3

Tổng 13

Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.

- Thực hiện phản ứng

Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống Eppendorf 0,2 ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau:

1) Cho 13µl hỗn hợp master mix vào các tube 0,2 ml.

2) Cho 2µl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng âm. 3) Cho 2µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp master mix của các tube mẫu.

4) Cho 2µl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương.

Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định.

Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.

- Chạy trên máy Realtime PCR

Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.

Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như sau (bảng 2.2).

Bảng 2.3. Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT-PCR

Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

RT 50 o C 15phút 1 95oC 2 phút PCR 95 o C 10 giây 40 60oC 40 giây - Đọc kết quả

Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu swab có virus cúm A/H5N1; A/H5N6 trình tự nucleotide của các gen M, H5 và N1, N6 sẽ được khuếch đại đặc hiệu thông qua những đoạn mồi chuyên biệt. Việc xác định sự có mặt của virus