4. Điểm mới của đề tài
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xác định sự lưu hành virus cúm A bằng phương pháp Realtime RT-PCR
- Phương pháp lấy mẫu: Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển được thực hiện theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-83:2011/BNNPTNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật- yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm bảo quản và vận chuyển.
+ Lấy dịch hầu họng (swab): Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy, thu dịch nhầy sau đó từ từ rút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản mẫu bằng đệm PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline), bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về Phân viện thú y Miền Trung để tiến hành xét nghiệm.
Mẫu swab gộp được bảo quản trong dung dịch chứa trong các ống chuyên đựng mẫu swab. Trộn xốc ống mẫu vẫn còn tăm bông bên trong 15 giây sau đó ly tâm ống ở 1000g trong 10 phút và thu dung dịch nổi vào các ống Eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống Eppendorf.
Sau khi xử lí mẫu, các ống Eppendorf được tiến hành tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu được mang ra rã đông.
+ Lấy mẫu huyết thanh: lấy máu ở tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch chân. Trước khi lấy máu cắt lông trên khu vực cần lấy, sát trùng bằng cồn Ethanol 70% rồi dùng kim tiêm vô trùng lấy từ 1ml đến 5ml máu. Máu lấy ra được chứa trong bơm tiêm, rút pit tong tạo khoảng trống, ký hiệu mẫu rồi để nghiêng ống nghiệm rồi đặt nghiêng 45o trong hộp đựng mẫu, để trong 1 đến 2 giờ ở nhiệt độ thường tránh ánh nắng, rồi sau đó chắt huyết thanh sang ống Eppendorf và ghi ký hiệu lên ống. Nếu không sử dụng huyết thanh ngay thì bảo quản ở 4oC trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở -20oC cho đến khi thực hiện phản ứng.
- Thực hiện thu mẫu swab tại chợ, trang trại chăn nuôi: mẫu được lấy ngẫu nhiên từ các hộ buôn bán gia cầm sống, các trang trại chăn nuôi gia cầm trên địa bàn huyện Lệ Thủy định kỳ đầu tuần thứ 3 của tháng lấy 4 mẫu gộp/1 đợt/tháng trong vòng 6 tháng, với tổng số mẫu lấy được là 24 mẫu gộp tương đương với 240 mẫu đơn và được gộp ngay tại nơi lấy mẫu, ký hiệu mẫu theo tên huyện - số thứ tự (ví dụ: LT - 01).
* Thiết bị và dụng cụ
- Tủ lạnh âm -20oC, -80oC; tủ lạnh thường 2- 8oC. - Tủ ấm 37oC.
- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.
- Máy ly tâm lạnh ống Eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.
- Máy Realtime PCR Biorad.
- Bộ micropipet các cỡ, ống Eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.
- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).
- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...
- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).
* Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm:
- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH.
- Nước dùng cho phản ứng sinh học phân tử không có Rnase.
- Ethanol tuyệt đối.
- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT
- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).
- MgCl2 (Promega) 25mM.
Bảng 2.1: Danh sách Primer & Prober
PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None
Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
H5-9S
Probe FAMTCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1 FAM BHQ1
Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None
Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None
Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None
N1-2 China
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
N6-1
Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1 FAM BHQ1
Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None
Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None
H7-6 Coda
Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG -BHQ1-
3’
FAM BHQ1
Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None
Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None
N9-1 CNIC Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC - BHQ1-3’ FAM BHQ1
Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None
* Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR xác định lượng
virus cúm gia cầm
- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).
- RNA đối chứng dương tính M, H5 của virus cúm A/H5N1, A/H5N6. - Hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) và probe (mẫu dò).
- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.
- Các nucleotide tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch đệm, Mg2+...
* Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR
- Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số
+ Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút pha nước phía trên sang ống Eppendorf mới có đánh ký hiệu mẫu.
+ Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở âm 700C.
- Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNR Mini
+ Cho 500l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA. + Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây.
+ Ủ ở nhiệt độ phòng (15-20oC) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.
+ Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh. + Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.
+ Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.
+ Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 20oC trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 70oC trong thời gian dài.
- Chuẩn bị hỗn hợp nhân gene (master mix)
Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống Eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào ống Eppendorf các thành phần với lượng như sau (bảng 2.1)
Bảng 2.2. Thành phần của master mix
TT Nguyên liệu Lượng (µl)
1 DW 4,3
2 2X ReactionBuffer 7,5
PPP
Primer forward (40uM)
0,9 Primer reverse (40uM)
Probe (10uM)
3 Enzyme mix 0,3
Tổng 13
Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.
- Thực hiện phản ứng
Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống Eppendorf 0,2 ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau:
1) Cho 13µl hỗn hợp master mix vào các tube 0,2 ml.
2) Cho 2µl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng âm. 3) Cho 2µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp master mix của các tube mẫu.
4) Cho 2µl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương.
Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định.
Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.
- Chạy trên máy Realtime PCR
Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.
Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như sau (bảng 2.2).
Bảng 2.3. Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT-PCR
Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
RT 50 o C 15phút 1 95oC 2 phút PCR 95 o C 10 giây 40 60oC 40 giây - Đọc kết quả
Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu swab có virus cúm A/H5N1; A/H5N6 trình tự nucleotide của các gen M, H5 và N1, N6 sẽ được khuếch đại đặc hiệu thông qua những đoạn mồi chuyên biệt. Việc xác định sự có mặt của virus thông qua phần mềm tạo đường cong và chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct:
+ Đối chứng dương tính cho giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 so với giá trị Ct đã biết.
+ Đối chứng âm tính không có giá trị Ct.
+ Mẫu dương tính khi đường cong khuyếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct ≤ 35.
+ Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại giống như đối chứng âm tính và không cho giá trị Ct.
+ Mẫu được xác định là nghi ngờ khi đường cong khuếch đại giống đối chứng dương nhưng giá trị ngưỡng Ct >35.
2.3.2. Phương pháp điều tra dịch tễ học
Thu thập thông tin về tình hình chăn nuôi giai đoạn 2013-2017 từ người chăn nuôi và Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình.
Để xác định các yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch cúm gia cầm tại huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình, chúng tôi sử dụng phiếu điều tra để điều tra tại 36 hộ có gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1 và 80 hộ không có gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1. Số liệu dịch tễ được thể hiện dưới dạng bảng tương liên 2 x 2 như sau:
Bảng 2.4. Bảng tương liên 2 x 2
Yếu tốnguy cơ Có bệnh Không có bệnh
Phơi nhiễm a b
Không phơi nhiễm c d
Tổng số a + c b + d
- Tỷ suất chênh (odd ratio - OR) được tính toán theo công thức:
OR= ad bc
OR là đại lượng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với yếu tố nguy cơ. OR > 1: Yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh (nguy cơ tăng). OR = 1: Không có ảnh hưởng, khác nhau giữa hai nhóm. OR < 1: Nguy cơ giảm (khi đối tượng nghiên cứu được bảo vệ).
- Giả thuyết: Ho: Các yếu tố nguy cơ không có sự sai khác trong việc làm phát sinh bệnh cúm gia cầm tại địa bàn nghiên cứu.
P > 0,05: Chấp nhận Ho.
P < 0,05: Không chấp nhận Ho (sự sai khác giữa các yếu tố nguy cơ trong việc làm phát sinh bệnh cúm gia cầm tại địa bàn nghiên cứu là giá trị OR lần).
2.3.3. Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên vịt sau tiêm phòng vaccine QB7412
- Bố trí thí nghiệm: Vịt được bố trí thử nghiệm là các thời điểm tiêm phòng khác nhau: Vịt con được lấy mẫu trước khi tiêm mũi 1 đồng thời tiêm mũi 1 lúc 14 ngày tuổi, và được lấy mẫu trước khi tiêm mũi 2, lặp lại mũi 2 lúc 28 ngày tuổi.
Số cá thể xét nghiệm mẫu là 30 cá thể . Lặp lại 3 lần lấy mẫu, 2 lần tiêm. Thời điểm lấy mẫu huyết thanh xét nghiệm vào các ngày tuổi: 14; 28 và 42; Tổng số mẫu xét nghiệm là 120 mẫu, được áp dụng theo công thức lấy mẫu đại diện và các mẫu lấy được lựa chọn ngẫy nhiên.
- Sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch trên vịt đối với vaccine QB7412
Bảng 2.5. Lịch tiêm phòng và lấy mẫu huyết thanh Nội dung Số lượng mẫu lấy (Trước tiêm phòng) 14 ngày Số lượng vịt (tiêm phòng lần 1) 14 ngày Số lượng mẫu lấy (Sau
tiêm phòng lần 1) 28 ngày Số lượng vịt (tiêm phòng lần 2) 28 ngày Số lượng mẫu lấy (Sau
tiêm phòng lần 2) 42
ngày
QB7412 30 30 30 30 30
Lô đối chứng 10 0 10 0 10
Ghi chú: Mẫu huyết thanh được lấy để làm xét nghiệm HI
* Nguyên liệu dùng cho phương pháp HI
- Micropipet đa kênh (8-12 kênh): 5-50l
- Micropipet đơn kênh: 50-200l, 100-1000l, đầu típ 200l, 1000l - Đĩa 96 giếng đáy hình chữ V, máng trộn chất phản ứng
- Kháng nguyên chuẩn subtype H5 4HA - Hồng cầu gà 1%
- Kháng huyết thanh chuẩn subtype H5 (dùng làm đối chứng dương tính) - PBS 0,01M; pH 7,2
* Trình tự tiến hành phản ứng
- Cho 25l PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng
- Cho 25l huyết thanh kiểm tra vào giếng đầu tiên
- Pha loãng huyết thanh kiểm tra theo cơ số 2, bằng cách trộn đều và chuyển 25l từ giếng 1 sang giếng 2, và tuần tự đến giếng 11, hút bỏ đi 25l ở giếng 11.
- Cho 25l kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ 1 đến 11. Thêm 25l PBS vào giếng 12 (giếng đối chứng hồng cầu).
- Lắc nhẹ đĩa và để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Cho 25l dung dịch hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, lắc đều. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 40 phút. Sau đó đọc kết quả.
* Đọc kết quả
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy và chảy xuống khi nghiêng đĩa với góc 45o.
- Kết quả phản ứng được ghi vào sơ đồ đĩa phản ứng HI
Tiêu chí đánh giá của Cục Thú y: hiệu giá HI ≥ 1/16 (4 log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể gia cầm; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4 log2); huyết thanh có kháng thể cao khi hiệu giá huyết thanh > 4log2, huyết thanh không có khả năng bảo hộ khi hiệu giá huyết thanh < 4log2.
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 và Win Episcope 2.0. Sử dụng phép thống kê Khi bình phương (χ2) theo từng nhóm chỉ tiêu nghiên cứu.
Tỷ lệ dương tính (%) =
Số mẫu dương tính
Số mẫu kiểm tra
Tỷ lệ bảo hộ (%)=
Số mẫu có hiệu giá kháng thể ≥ 4log2
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. QUY MÔ CHĂN NUÔI TRÊN ĐịA BÀN HUYỆN LỆ THỦY, TỈNH QUẢNG BÌNH QUẢNG BÌNH
Huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình có vị trí địa lý từ: 16055’ đến 17022’ vĩ độ Bắc và từ 106025’ đến 106059’ độ kinh Đông; Phía Bắc giáp huyện Quảng Ninh, Phía Nam giáp huyện Vĩnh Linh (tỉnh Quảng Trị), Phía Đông giáp biển Đông và Phía Tây giáp tỉnh Savanakhẹt của nước Cộng hoà Dân chủ Nhân dân Lào; có các trục đường giao thông chính nối 2 đầu đất nước như đường Quốc Lộ 1A, đường Hồ Chí Minh (nhánh Đông và Tây), đường sắt Bắc Nam tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng liên kết, giao thương và hợp tác phát triển với các địa phương trong tỉnh, vùng Duyên hải miền Trung và với cả nước
Huyện Lệ Thủy có 4 dạng địa hình chính, gồm: vùng núi cao, vùng đồi trung du, vùng đồng bằng và vùng cồn cát ven biển, có địa hình phía Tây là núi cao và thấp dần từ Tây sang Đông với khí hậu đặc trưng của chế độ Nhiệt đới gió mùa 1 năm được chia làm 2 màu rõ rệt (mùa mưa và mùa khô). Nhiệt độ trung bình năm là 24,6oC với lượng mưa hàng năm cao dao động trong khoảng 1.448mm - 3.000mm tập trung vào các tháng 9,10,11. Nhiều năm về mùa mưa thường có lũ lụt trên diện rộng và bão lốc; mùa khô nắng gắt có gió Tây Nam khô nóng lượng nước bốc hơi lớn đạt 200mm/tháng, độ ẩm không khí thấp, gây hạn hán nghiêm trọng. Đây là những yếu tố gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp và thủy sản, làm ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế - xã hội của huyện.
Theo số liệu Cục thống kê Quảng Bình, diễn biến tổng đàn gia cầm nuôi trên