VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

M ỤC LỤC

4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu nấm bệnh đạo ôn hại lúa được thu thập tại 3 vùng là Quảng Công, Hương Phong và Phú Lương của tỉnh Thừa Thiên Huế đưa về phân lập tại Phòng thí nghiệm của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Thừa Thiên Huế.

- Các lá lúa của các giống Xi23, Nếp, Khang Dân (thu thập giai đoạn lúa đẻ

nhánh) tại 3 vùng là Quảng Công, Hương Phong và Phú Lương đảm bảo không bị

bệnh để tiến hành lây nhiễm nhân tạo.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1. Điều tra cơ cấu giống lúa trong vụ Đông Xuân 2017-2018 tại 3 vùng

Thu thập số liệu thứ cấp từ 3 xã (Qua báo cáo cơ cấu giống của HTX) để từ đó

lựa chọn ra các giống lúa cần điều tra, theo dõi.

2.3.2.2. Điều tra diễn biễn bệnh đạo ôn gây hại trên 6 giống lúa tại 3 vùng: xã

Hương Phong-thị xã Hương Trà; xã Quảng Công-huyện Quảng Điền; xã Phú

Lương-huyện Phú Vang tỉnh Thừa Thiên Huế.

Theo Quy chuẩn Quốc gia Việt Nam (QCVN 01-166:2014/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại lúa; Ban hành kèm

theo Thông tư số 16/2014/TT- BNNPTNT ngày 05 tháng 6 năm 2014).

Phương pháp điều tra:

Thời gian điều tra: Điều tra định kỳ: 7 ngày/lần ở tuyến điều tra với các yếu tốđiều tra trong khu vực điều tra cố định ngay từ đầu vụ.

Điểm điều tra: Mỗi yếu tốđiều tra 10 điểm tương đối ngẫu nhiên và đồng đều trên tuyến điều tra. Điểm điều tra phải cách bờ ít nhất 2 mét.

- Phương pháp điều tra

Đối với bệnh đạo ôn lá:Đếm toàn bộ số lá và số lá bị bệnh trên 10 dãnh có trong điểm điều tra.

- Các chỉ tiêu cần theo dõi:

Tổng số lá (bông) bị bệnh

Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 % Tổng số lá (bông) điều tra

(N1 x 1) + ... + (Nn x n) Chỉ số bệnh (%) = x 100 % N x 9 Trong đó: N1: là số lá (bông) bị bệnh ở cấp 1; Nn: là số lá (bông) bị bệnh ở cấp n; N: là tổng số lá (bông) điều tra;

9: là cấp bệnh cao nhất của thang phân cấp.

Chỉ số bệnh trên lá lúa dựa vào thang phân cấp

+ Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 3: từ 1 - 5% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 5: > 5 - 25% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 7: > 25 - 50% diện tích lá bị bệnh; + Cấp 9: > 50 % diện tích lá bị bệnh.

Chỉ số bệnh trên cổ bông lúa dựa vào thang phân cấp + Cấp 0: không bị bệnh

+ Cấp 1: vết bệnh có trên 1 vài cuống bông hoặc nhánh thứ cấp.

+ Cấp 3: vết bệnh có trên một vài gié sơ cấp hoặc phần giữa của trục bông.

+ Cấp 5: vết bệnh bao quanh một phần gốc bông ( đốt) hoặc phần ống rạ phía dưới của trục bông.

+ Cấp 7: vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bông, hoặc phần trục bông gần cổ

bông, trên bông có 30% số hạt chắc trở lên.

+ Cấp 9: toàn bộ cổ bông bị bệnh, số hạt chắc trên bông dưới 30%.

Đường cong tiến triển bệnh (AUDPC - Area Under Disease Progress Curve) (Campell và Maddem, 1990).

Trong đó:

yi, yi+1: tỉ lệ bệnh vào thời điểm ghi nhận i và i+1

ti, ti+1: thời điểm ghi nhận i và thời điểm kế tiếp i+1 (ngày)

2.3.2.3. Tình hình sử dụng thuốc hóa học phòng trừ bệnh đạo ôn

- Điều tra số liệu thứ cấp: các số liệu về tình hình sử dụng thuốc hóa học phòng trừ đạo ôn thu thập được từ các xã Quảng Công, Hương Phong và Phú Lương , kết hợp

thông tin khuyến cáo sử dụng các loại thuốc phòng trừ bệnh đạo ôn của nhà sản xuất.

- Điều tra số liệu sơ cấp: Sử dụng phương pháp nghiên cứu điều tra phỏng vấn

bằng phiếu điều tra được soạn thảo riêng. Tiến hành điều tra 50 hộ/xã thuộc 3 vùng Quảng Công, Hương Phong và Phú Lương về các chỉ tiêu:

+ Tình hình sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh đạo ôn: tên thuốc, liều lượng, số lần phun trên 1 vụ

+ Những thói quen khác của người dân khi sử dụng thuốc hóa học phòng trừ đạo ôn: thời điểm phun (sáng, trưa, tối), những quyết định phun thuốc của người dân

(phun theo diễn biến bệnh, theo chỉ đạo của hợp tác xã, phun định kì)

2.3.2.4. Thu thập mẫu bệnh đạo ôn trên 6 giống lúa tại 3 vùng, phân lập và làm thuần nấm trong phòng thí nghiệm

Phương pháp thu mẫu: Thu mẫu từ những vết bệnh có triệu chứng ban đầu đến

những vết bệnh có triệu chứng điển hình. Mẫu thu cách bờ 1-2m.

Phương pháp phân lập: thu mẫu bệnh về tiến hành rửa qua nước cất vô trùng cho sạch bụi bẩn, tiếp theo rửa qua cồn để loại bỏ bớt tạp nấm, vi khuẩn trên bề mặt

mẫu bệnh, sau đó xịt lại nước cất khử trùng để làm sạch mẫu bệnh lại một lần nữa.

Dùng giấy vệ sinh quấn 2 đầu của mẫu bệnh rồi cho vào khay, phun xịt nước vào, sau 1-2 ngày nấm mọc cấy bào tử sang môi trường WA, theo dõi để cấy truyền nấm sang môi trường PDA.

Vô trùng dụng cụ và chuẩn bị môi trường:

Vô trùng dụng cụ:

+ Đĩa peptri, que cấy, kim, ống nghiệm và một số dụng cụ khác được hấp thủy

rồi sấy ở nhiệt độ 140OC với thời gian 120 phút

+ Cồn, đèn cồn và một số dụng cụ khác được khử trùng bằng cồn 70% rồi hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn

+ Khay, bàn và bề mặt làm việc khác được khử trùng bằng cồn 70% và tia UV trong tủ cấy 30 phút

Môi trường thạch nước cất (WA)

Agar: 20g và Nước cất: 1 lít

Cho 20g Agar vào 1 lít nước cất chứa sẵn trong chai, khuấy đều và đậy nắp, rồi

tiến hành đem đi hấp vô trùng, sau khi nấu xong thì đổ vào đĩa, rồi để nguội, đậy nắp đĩa lại. Môi trường này dùng để làm thuần nấm Pyricularia oryzea Cav.

Môi trường thạch khoai tây (PDA)

+ Khoai tây: 250g

+ Đường glucose: 20g

+ Agar: 20g

+ Nước cất: 1 lít

Khoai tây không gọt vỏ, rửa sạch, cắt nhỏ thành những miếng vuông, sau đó

nấu khoai tây với nước cất trong vòng 30 phút cho mềm, dùng rây lọc lấy dung dịch nước cất khoai tây. Thêm 20g đường glucose và 20g agar vào dung dịch. Bổ sung nước cất cho đủ 1 lit rồi khuấy đều, đậy kín và đem hấp vô trùng. Tiếp theo đổ một lượng môi trường thích hợp vào đĩa petri đã được vô trùng, để nguội rồi đậy nắp đĩa.

Môi trường này để nuôi cấy sự sinh trưởng của tản nấm Pyricularia oryzea Cav.

Cấy truyền từ các đĩa phân lập: cấy truyền là bước trung gian giữa phân lập từ

mẫu bệnh và làm thuần vi sinh vật gây bệnh.

Quy trình cấy truyền: Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày dưới kính hiển vi và đánh

giá sự phát triển của sợi nấm từ các miếng cấy. Xác định xem có nhiều hơn một loài nấm mọc lên hay không. Cấy truyền khi sợi nấm mọc được khoảng 5mm từ miếng

cấy, cấy sang môi trường PDA.

Phương pháp làm thuần: làm thuần nấm gây bệnh bằng phương pháp cấy bào tử ( Burgess và cs, 2008).

1. Khử trùng que cấy.

2. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm

trên mặt thạch có lẫn bào tử hoặc lấy một chút bào tử từ khối bào tử lớn của nấm

Pyricularia oryzae Cav. rồi cho vào ống nghiệm chưa 10ml nước cất vô trùng.

3. Lắc ống nghiệm để phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách

kiểm tra một giọt dung dịch bào tử dưới kính lúp soi nổi.

4. Làm loãng với nước cất vô trùng nếu cần

5. Đổ dịch bào tử vào đĩa Petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch nước cất. 6. Đổ dịch bào tử từ đĩa Petri đi. Một số bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch.

7. Để dựng đứng đĩa Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm.

8. Kiếmtra đĩa Petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới

9. Dùng một que cấy dẹp cắt lấy ra một bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi trường mới

Phương pháp bảo quản nấm bệnh đã phân lập được: Mẫu nấm bảo quản để

dùng trong quá trình lây bệnh nhân tạo hoặc các thí nghiệm khác. Dùng phương pháp

bảo quản trong nước cất vô trùng, mẫu bảo quản trong điều kiện 4OC.

Mật độ quá cao Đúng mật độ

Hình 2.1. Quy trình cấy đơn bào tử và thao tác lựa chọn bào tử đúng cách (Burgess

Mẫu bệnh thu thập được

Cắt vết bệnh

Rửa mẫu bệnh bằng nước cất vô trùng

Đặt mẫu bệnh để ẩm trong đĩa petri vô trùng

Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 - 2 ngày (nấm mọc tự nhiên)

Quan sát bào tử dưới kính hiển vi

Cấy bào tử sang môi trường WA

Cấy truyền sang môi trường PDA

Làm thuần bằng cấy đơn bào tử

Hình 2.2. Vết bệnh đạo ôn điển hình trên lá, cổ bông

Hình 2.3. Mẫu bệnh đạo ôn để ẩm trong vòng 2-3 ngày

Hình 2.5. Cấy đơn bào tử bằng phương pháp pha loãng

2.3.2.5. Kiểm tra tính gây bệnh của nấm đạo ôn bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo

Kiểm tra tính gây bệnh bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo

- Sử dụng lá lúa của giống lúa Xi23, Nếp, Khang dân thu thập tại Quảng Công, Hương Phong và Phú Lương để thực hiện thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo.

- Các chủng nấm bệnh đạo ôn được phân lập tại Quảng Công (QC), Hương Phong (HP) và Phú Lương ( PL).

Bảng 2.2. Các chủng nấm được sử dụng để lây nhiễm nhân tạo

STT Ký hiệu các chủng nấm Địa điểm thu thập

1 QC Quảng Công-Quảng Điền

2 HP Hương Phong-Hương Trà

3 PL Phú Lương-Phú Vang

- Lây nhiễm nhân tạo: Hấp vô trùng tất cả các dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm. Nấm đạo ôn được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 7 ngày, loại bỏ nấmđạo ôn khí

sinh. Hòa bào tử trong nước cất vô trùng và điều chỉnh dung dịch nấm đến nồng độ

1x105 bào tử/1ml, có pha thêm 1% gelatin để tăng độ bám dính lên lá lúa, phun 20ml dịch bào tử nấm lên lá lúa của mỗi giống và ủ trong điều kiện tối, độ ẩm 100%, trong 24

giờ, sau đó lấy ra và để trong điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày và để duy trì nhiệt độ

phòng 24-280C.

- Quan sát các triệu chứng biểu hiện trên lá lúa đã được lây bệnh, các triệu

chứng phải giống như đã quan sát ban đầu trên lá lúa bị bệnh ngoài đồng ruộng.

- Kết quả được đọc sau 5 ngày lây nhiễm, có 6 cấp độ bệnh được ký hiệu từ 0-5,

trong đó: 0: không có vết bệnh, kháng bệnh. 1: Vết bệnh có đường kính 1 mm, kháng bệnh 2: Vết bệnh có đường kính 2 mm, kháng bệnh 3: Vết bệnh có đường kính 3-4 mm, mẫn cảm nhẹ. 4: Vết bệnh có đường kính 5-6 mm, mẫn cảm. 5: Vết bệnh >6 mm, cả lá bị nhiễm bệnh nặng, mẫm cảm cao.

- Đánh giá màu sắc của bệnh: Vết bệnh màu nâu được ký hiệu là B (brown), phản ứng kháng. Vết bệnh màu vàng được ký hiệu là Y (yellow), kháng yếu. Vết bệnh màu xanh được ký hiệu là G (green), mẫn cảm (Tosa và cs, 2004).

- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vết bệnh (mm) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (AUDPC - Area Under Disease Progress Curve) (Campell và Maddem, 1990).

Đường kính vết bệnh (mm):

ĐKVB (mm) = Chiều dài vết bệnh + Chiều rộng vết bệnh

2

2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu

2.3.3.1. Phương pháp xử lý số liệu thứ cấp

Tổng hợp và chọn lọc các số liệu có liên quan đến vấn đề nghiên cứu để khái quát về vấn đề sắp nghiên cứu và trích dẫn vào bài viết.

2.3.3.2. Phương pháp xử lý số liệu sơ cấp

Số liệu được xử lý bằng Excel với các chỉ tiêu như trung bình, AUDPC và phần mềm thống kê chuyên dụng IBM SPSS, Statistix 10.0.

2.4. TÌNH HÌNH THỜI TIẾT VỤ ĐÔNG XUÂN NĂM 2017-2018 CỦA TỈNH THỪA THIÊN HUẾ

Tỉnh Thừa Thiên Huế thuộc vùng duyên hải Miền Trung có khí hậu đặc trưng

của vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, với điều kiện nóng ẩm, mưa nhiều, nắng mưa xen

kẽ, sáng sớm có sương mù, biên độ nhiệt độ ngày và đêm chênh lệch khá lớn trong vụ Đông Xuân nên rất thuận lợi cho các đối tượng sâu bệnh phát sinh phát triển gây hại

Bảng 2.3. Khí hậu thời tiết vụ Đông Xuân 2017-2018 của tỉnh Thừa Thiên Huế

Tháng

Nhiệt độ (0C) Độ ẩm (%) Lượng mưa

Số giờ nắng

TB Max Min TB Min Số Ngày Lượng mưa (mm) 01/2018 20,3 23,4 18,6 93 58 23 160,3 42 02/2018 19,3 23,1 17 90 59 12 47,7 88 03/2018 20,3 27,8 20 88 59 6 20,8 156 04/2018 20,7 30,0 21,3 87 58 11 208,1 179 05/2018 27,3 37,0 19,5 85,2 49 9 51,5 191

(Nguồn: Đài khí tượng thủy văn tỉnh Thừa Thiên Huế)

Qua bảng 2.3 chúng tôi nhận định một số đặc điểm nổi bật của điều kiện khí

hậu thời tiết vụ Đông Xuân 2017-2018 tại tỉnh Thừa Thiên Huế như sau:

- Về nhiệt độ: nền nhiệt độ vụ Đông Xuân 2017-2018 ở Thừa Thiên Huế tương đối thuận lợi cho nấm đạo ôn phát sinh gây hại (nhiệt độ trung bình từ 19,30C-20,70C, nhiệt độ tối thấp 170C, nhiệt độ tối cao 300C).

Trong tháng 1/2018, nhiệt độ trung bình tương đối thấp (20,30C), ẩm độ trung

bình tương đối cao (93%) và lượng mưa cao (160,3mm) đây là điều kiện thuận lợi thích

hợp cho nguồn nấm bệnh đạo ôn tồn tại, tích luỹ trên lúa chét, cỏ dại và nguy cơ phát sinh gây hại trên lúa vụ Đông Xuân 2017-2018 sau khi gieo sạ.

Trong tháng 2/2018, nhiệt độ trung bình có giảm nhưng không đáng kể (19,30C), tuy nhiên trong thời gian này, sáng sớm có sương mù ban ngày trời nắng nên tạo điều

kiện thuận lợi cho bệnh đạo ôn phát triển lây lan gây hại trên diện rộng.

Tháng 3/2018, nhiệt độ tăng lên (20,30C), lượng mưa vẫn tiếp tục giảm (89,3mm)

số giờ nắng lớn (156 giờ) kết hợp sáng sớm có sương mù, xen kẽ giữa các ngày nắng có các ngày mưa, ẩm độ cao, bên cạnh đó một số ruộng nông dân bón phân không cân đối,

bón nhiều phân đạm nên tình hình bệnh đạo ôn phát triển mạnh.

Tháng 4/2018, nhiệt độ trung bình thấp (20,70C), ẩm độ cao, sáng sớm có sương mù, đây là điều kiện thời tiết khá thuận lợi cho nấm đạo ôn phát triển gây hại gia tăng,

trùng với giai đoạn cây lúa làm đòng chuẩn bị trổ nên bệnh đạo ôn cổ bông phát sinh

gây hại nặng trên một số giống nhiễm bệnh như Nếp, Xi23, BT7, …

- Về ẩm độ: ẩm độ giảm dần từ tháng 1 đến tháng 4 nhưng chênh lệch không đáng kể giữa các tháng gần nhau.

Vụ Đông Xuân 2017-2018 lượng mưa chủ yếu tập trung vào tháng 1 (160,3mm) và tháng 4 (208,1mm) số giờ nắng lại cao là điều kiện thuận lợi cho bệnh đạo ôn phát

triển.

- Tuy nhiên vào tháng 3 có xuất hiện 2 đợt không khí lạnh vào các ngày 8-9/3, 19-21/3, nhiệt độ giảm, ẩm độ tăng cao, có những ngày chịu ảnh hưởng của không khí

lạnh có mưa, mưa rào nhiều nơi tạo điều kiện cho bệnh đạo ôn phát triển và gây hại

nặng ở một số vùng.

Nhận thấy thời tiết chung ở Thừa Thiên Huế tương đổi ẩm thấp, có sự chênh lệch biên độ nhiệt độ giữa ngày và đêm, kết hợp sáng sớm có sương mù, đây chính là điều kiện thuận lợi cho nấm bệnh đạo ôn phát sinh phát triển gây hại trên cây lúa.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. ĐIỀU TRA CƠ CẤU CÁC GIỐNG LÚA TẠI 3 VÙNG QUẢNG CÔNG, HƯƠNG PHONG, PHÚ LƯƠNG HƯƠNG PHONG, PHÚ LƯƠNG

Bảng 3.1. Cơ cấu các giống lúa tại Quảng Công, Hương Phong, Phú Lương

TT Địa điểm Tổng diện tích

(ha) Giống Diện tích (ha) Tỷ lệ (%) 1 Quảng Công 101,8 Khang dân 56,0 55,0 Xi23 20,8 20,5