30
3.6.4.1. Vi sinh vật tổng số
Vi sinh vật là cơ thể sống có kích thước rất nhỏ quan sát được bằng kính hiển vi, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus.
Vi sinh vật tổng số là tất cả vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên môi trường dinh dưỡng chung, ở 30 10C sau một thời gian nuôi cấy nhất định trong 24 – 72 h.
Xác định tổng số vi sinh vật tổng số để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm…
Phương pháp này cho phép phát hiện những tế bào vi sinh vật còn sống có trong mẫu (ở cả dạng rắn và lỏng). Mặc dù đây không phải là một phương pháp đếm vi sinh vật một cách nhanh chóng nhưng nó thường được dùng như là phương pháp chuẩn để xác định số lượng vi sinh vật thực phẩm.
Nguyên tắc:
Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịnh pha loãng) vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30- 300 khuẩn lạc/hộp. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc lên. Có thể coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào [6].
-Thiết bị:
+ Hộp Petri
+ Que trang thủy tinh hoặc kim loại + Ống nghiệm dùng để pha loãng mẫu -Hóa chất:
+ Nước cất vô trùng, đã qua lọc. + Môi trường thạch thích hợp. Thực hiện cấy trên môi trường thạch TGA:
- Pepton: 5g - Glucose: 5g
31 - Thạch: 15 g
- Yeast Extract Powder: 2,5g - Nước cất: 1000 ml
- Cách pha:
Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250ml, mỗi bình 150ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 121oC trong thời gian 15 - 20 phút. Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối, ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC không quá 30 ngày.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị môi trường thích hợp và dịch pha loãng, sau đó khử trùng cùng với các dụng cụ cần dùng.
Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết -Cấy trong môi trường thạch
+ Đưa một cách vô trùng 1ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cấn thiết vào đĩa Petri vô trùng.
+ Rót khoảng 15 – 18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy (nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa đã có mẫu. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp và từ mỗi độ pha loãng cần lặp lại ít nhất là 2 hộp.
+ Chộn theo kỹ thuật được chuẩn hóa. Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội.
-Cấy trên môi trường thạch
+ Rót khoảng 15 – 18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy (nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa petri đã vô trùng.
+ Đĩa được xếp trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội. Sau đó thường để các hộp này ở nhiệt độ 30˚C trong 2 – 3 ngày kiểm tra độ vô trùng của chúng.
+ Đưa một cách vô trùng một thể tích 0,05 – 0,1 ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết lên bề mặt thạch chứa trong đĩa Petri.
32
+ Dùng que trang vô trùng dàn đều thể tích này lên khắp bề mặt môi trường. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp sao cho trên mỗi hộp sẽ có từ 30 – 300 khuẩn lạc và từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp.
+ Lật hộp lại và đem nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tùy theo sản phẩm cần nghiên cứu và tùy theo lọai vi sinh vật mà người ta muốn đánh giá sự phát triển của nó. Nhiệt độ thường 22˚C, 30˚C hay 37˚C và thời gian nuôi cấy là 24 giờ, 48 giờ.
Tính kết quả :
Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính như sau: A(CFU/g hay CFU/ml) = 𝑁
𝑛₁𝑉𝑓₁ +⋯+ 𝑛₂𝑉𝑓₂
Trong đó :
A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
Ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi: Độ pha loãng tương ứng
3.6.4.2. Nấm men, nấm mốc
Đếm nấm men và nấm mốc theo TCVN 4993-89 Nguyên tắc:
-Dùng môi trường nuôi chọn lọc quy định và 1 lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm có dạng khác để đổ đĩa.
-Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng điều kiện bằng cách sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu.
-Nuôi cấy hiếu khí các đĩa ở 25oC trong 3, 4 hoặc 5 ngày.
-Tính số nấm men và nấm mốc trên gam hoặc trên mililit mẫu thử theo số khuẩn lạc xác định được trên đĩa ở độ pha loãng đã chọn sao cho đạt được kết quả có ý nghĩa.
33 Môi trường nuôi cấy :
-Chất chiết nấm men: 5g -Dectroza ( C6H12O6): 20g -Cloramphenicol ( C11H12Cl2O5): 0,1g -Thạch: 12 – 15g -Nước: 1000ml Cách tiến hành:
Sử dụng 2 đĩa petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml mẫu thử (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml huyền phù (nếu sản phẩm có dạng khác) lần lượt cho vào từng đĩa.
Sử dụng tiếp 2 đĩa petri nữa. Dùng pipet vô trùng khác lấy 1 ml dung dịch pha loãng 10-1 lần lượt cho vào từng đĩa (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10-2 (nếu sản phẩm có dạng khác). Nếu cần, lặp lại thao tác trên với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.
Từ bình lấy thêm khoảng 15 ml môi trường thạch - chất chiết nấm men - dectroza - cloramphenicol làm lỏng và đã được giữ ở 45 ± 1oC trong bếp cách thủy (4.3) rồi lần lượt cho vào từng đĩa petri. Thời gian từ khi kết thúc chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 10-1, nếu là sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường vào đĩa không quá 15 phút.
Trộn cẩn thận chất nuôi cấy với môi trường và để đông đặc lại bằng cách đặt đĩa petri trên 1 mặt phẳng mát nằm ngang. Chuẩn bị đĩa kiểm tra chứa 15 ml môi trường để kiểm tra độ tiệt trùng.
Đọc kết quả:
+ Úp các đĩa và đặt chúng vào tủ ấm ở 25 ± 1 oC. Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa sau khi nuôi 3, 4 và 5 ngày.
+ Sau 5 ngày, giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Nếu nấm mốc phủ kín trên các đĩa hoặc khó đếm được các khuẩn lạc tách biệt hẳn thì giữ lại số đếm được sau khi nuôi 4 ngày hoặc thậm chí 3 ngày. Trong trường hợp này, cần ghi lại thời gian nuôi là 3 hoặc 4 ngày vào biên bản.
34
+ Nếu cần có thể kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men và nấm mốc với khuẩn lạc của vi khuẩn dựa vào các hình thái của chúng.
Tính kết quả :
Số nấm men và nấm mốc, X, trên gam hoặc trên mililit được tính theo công thức:
X = (n1 +0,1n2).d∑C
Trong đó:
ΣC: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa; n1: Số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ nhất; n2: Số đĩa đếm được ở dung dịch pha loãng thứ hai; d: Độ pha loãng cho số đếm thứ nhất