3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là vịt nuôi tại địa bàn các xã của huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.
Chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ vịt bệnh nuôi tại địa phương nghiên cứu.
2.1.2. Phạm vi và thời gian nghiên cứu
Địa điểm lấy mẫu bệnh phẩm: tại 6 xã có hộ chăn nuôi vịt trên địa bàn huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.
Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Vi trùng - Truyền nhiễm, Khoa chăn nuôi - Thú y, trường Đại học Nông Lâm Huế.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11 năm 2015 đến tháng 7 năm 2016.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra tình hình bệnh do Salmonella trên vịt nuôi tại các xã thuộc huyện
Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.
- Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong mẫu bệnh phẩm từ vịt mắc bệnh trên địa bàn huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.
- Xác định một số đặc điểm sinh học đặc trưng của chủng vi khuẩn
Salmonella phân lập được từ mẫu bệnh phẩm:
+ Kiểm tra hình thái vi khuẩn + Kiểm tra đặc tính sinh hóa
+ Xác định độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm
+ Xác định mức độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với một số loại thuốc kháng sinh.
- Xây dựng phác đồ điều trị thử nghiệm trên vịt với các loại kháng sinh mẫn cảm.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Vật liệu nghiên cứu 2.3.1.Vật liệu nghiên cứu
* Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ vịt bị bệnh có triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh do nhiễm Salmonella nuôi tại các hộ gia đình trên địa bàn huyện Hoài
Nhơn, tỉnh Bình Định. Mẫu bệnh phẩm dùng trong nghiên cứu là lách của vịt bị bệnh.
* Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch
- Vịt con 10 ngày tuổi
* Dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm
+ Buồng cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm, nồi hấp.
+ Kính hiển vi, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, bình tam giác, cốc đong, cân phân tích, phiến kính, túi nilon, dao, kéo, panh, xylanh, pipet, ống eppendorf.
* Các loại môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu
- Môi trường nuôi cấy, phân lập
+ Môi trường BPW (Buffered Pepton Water) tiền tăng sinh vi khuẩn.
+ Môi trường thạch SS (Salmonella - Shigella agar) dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn.
+ Môi trường canh thang để giữ giống vi khuẩn.
+ Môi trường KIA (Kingler-Ion-Agar), Citrat, MUI (Urea-Indol), MR (Rouge Methyl), Glucose, Lactose, Saccarose và môi trường thử khả năng di động (Mobility) dùng để giám định vi khuẩn Salmonella.
+ Môi trường MHA (Muller Hinton Agar) dùng để thử nghiệm kháng sinh đồ.
+ Thuốc thử Kovac’s, chỉ thị Methyl Red
+ Thuốc nhuộm Gram (tím Genthian, dung dịch Lugol, cồn, đỏ Fuchsin) + Giấy tẩm kháng sinh (do công ty TNHH Nam Khoa sản xuất).
2.3.2. Phương pháp điều tra
Sử dụng phiếu điều tra, đến tậnhộ gia đình để phỏng vấn các hộ chăn nuôi vịt trên địa bàn các xã nghiên cứu thuộc huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định.
2.3.3. Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm được lấy từ các xã Hoài Mỹ, Tam Quan Nam (vùng ngập nước), Hoài Đức, Hoài Thanh (vùng ven sông) và Hoài Phú, Hoài Sơn (vùng khô). Tổng số mẫu bệnh phẩm là 90, mỗi vùng lấy 30 mẫu.
- Vịt mắc bệnh do Salmonella còn sống hay vừa mới chết được mổ khám và lấy lách cho vào túi nilon vô trùng, buộc kín, bảo quản ở nhiệt độ thích hợp và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thời gian cho phép.
Mẫu được bảo quản ở âm 200C cho đến khi phân tích nếu không được xét nghiệm ngay.
Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông, thì có thể bảo quản trong tủ lạnh hay thùng xốp ở 0-40C nhưng thời gian không được quá 36 giờ.
Lưu ý mẫu không có giá trị khi được lấy từ vịt đã chết quá 3 giờ, vi sinh vật đường ruột xâm nhập vào phủ tạng gây tạp nhiễm sau khi chết.
2.3.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella 2.3.4.1. Phương pháp xử lý mẫu 2.3.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
Đối với mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi phân tích. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ thường sau đó tăng nhiệt độ dần lên 450C trong 15 phút. Cần lắc túi chứa mẫu để tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu.
2.3.4.2. Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Salmonella được phân lập theo quy chuẩn ISO 6579:2002, có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Mẫu sau khi xử lý được nuôi cấy, phân lập theo sơ đồ trình bày ở Hình 2.1.
2.3.4.3. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn
Tiêu bản vi khuẩn được nhuộm bằng phương pháp Gram và xem kính hiển vi với vật kính dầu (10 x 100).
2.3.4.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường KIA để xác định khả năng lên men đường Glucose, Lactose, khả năng sinh H2S và khả năng sinh hơi của vi khuẩn. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra ria đều trên phần thạch nghiêng và cấy chích sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 370C sau 18-24 giờ thì đọc kết quả.
+ Khả năng lên men đường Lactose: Vi khuẩn lên men đường Lactose (dương tính) sẽ làm phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, trường hợp âm tính thì môi trường không đổi màu.
+ Khả năng lên men đường Glucose: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường Glucose (dương tính) thì phần thạch đứng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, ngược lại nếu vi khuẩn không có khả năng lên men đường Glucose (âm tính) thì phần thạch đứng giữ nguyên màu đỏ.
+ Khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi làm thạch bị nứt và bị đẩy lên khỏi đáy ống nghiệm; trường hợp sinh hơi yếu thì trong lòng thạch có bọt khí.
+ Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S thì phần thạch đứng có màu đen. Do H2S được hình thành từ các acid amin chứa lưu huỳnh có trong pepton hoặc Sodiumthiosulphate (Na2S2O3) có trong môi trường, H2S phản ứng với FeSO4 theo phản ứng sau:
H2S + FeSO4 = FeS↓(màu đen) + H2SO4
Kiểm tra khả năng di động (Motility)
Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy. Vi khuẩn không có khả năng di động thì toàn bộ môi trường vẫn trong.
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Urea-Indol
+ Khả năng sinh Ure: Vi khuẩn có men Urease sẽ phân giải Ure thành NH3
làm pH của môi trường thay đổi, khi đó chất chỉ thị màu Phenol red chuyển môi trường sang màu hồng cánh sen.
+ Khả năng sinh Indol: Trong môi trường Urea - Indol có chứa Tryptophan là một acid amin mà một số vi khuẩn có khả năng phân giải và sinh hơi nhờ men Tryptophanaza. Khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào môi trường có cấy vi khuẩn có khả năng phân giải Tryptophan sinh Indol thì trên bề mặt môi trường sẽ xuất hiện vòng màu đỏ.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường citrat
Natri citrat là một muối của acid citric, một hợp chất hữu cơ. Để phát hiện khả năng sử dụng citrat của vi khuẩn người ta nuôi cấy vi khuẩn vào trong môi trường Simmons có natri citrat, đây là phân tử có chứa một anion, cũng là một nguồn carbon duy nhất, ngoài ra trong môi trường còn có (NH4)H2PO4, là một nguồn nitro duy nhất. Nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng citrat từ natri citrat thì sẽ kéo theo sự khử được nitro từ muối amoni với sản phẩm tạo thành là amoni hydroxyd (NH4OH) làm kiềm hoá môi trường, do đó sẽ làm cho chất chỉ thị xanh bromthymol trong môi trường chuyển sang màu xanh nước biển. Trường hợp vi khuẩn không sử dụng citrat thì môi trường không đổi màu.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường MR
Một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh các acid mạnh (lactic, acetic, formic…) từ glucose bằng cách lên men, điển hình là vi khuẩn đường ruột với một số loài có thể sản xuất ra đủ một lượng acid mạnh làm cho môi trường nuôi cấy luôn giữ ở pH = 4,4. Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn chỉ cần nhỏ đỏ Methyl (Methyl Red) vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau 48-72 giờ (thường đỏ, còn âm tính thì môi trường có màu vàng.
Kiểm tra khả năng lên men đường Lactose, Glucose và Saccharose
Dấu hiệu thể hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn trong các môi trường đường được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Dấu hiệu thể hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn
Môi trường Âm tính Dương tính
Glucose (lỏng) Đỏ, ống Dulham chìm Vàng, ống Dulham nổi
Kiểm tra khả năng dung huyết
Có 3 dạng dung huyết (Trần Đức Hạnh, 2011): Dạng dung huyết alpha (α), vòng dung huyết hơi trong bao quanh vòng màu xanh lục sát khuẩn lạc. Dạng dung huyết hoàn toàn beta (β), vòng dung huyết trong suốt không màu, có bờ rõ ràng. Dạng gamma (γ), hoàn toàn không dung huyết.
2.3.5. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn Salmonella trên động vật
thí nghiệm
Để xác định độc lực của vi khuẩn chúng tôi sử dụng phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các vi khuẩn từ môi trường giữ giống được cấy chuyền vào môi trường BHI. Canh trùng được bồi dưỡng ở 37oC trong 24h.
Bước 2: Kiểm tra nồng độ vi khuẩn trước khi tiêm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên thạch.
Bước 3: Mỗi chủng vi khuẩn được chọn sẽ tiêm truyền trên 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, với liều tiêm là 0,2ml/con vào xoang phúc mạc. Lô đối chứng gồm 2 chuột được tiêm dung dịch NaCl 0,9% với liều tiêm và đường tiêm tương tự.
Bước 4: Kiểm tra và theo dõi thời gian chuột chết, số lượng chuột chết trong 3 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
Bước 5: Mổ khám và phân lập vi khuẩn từ máu tim của chuột chết.
2.3.6. Phương pháp kháng sinh đồ
Để xác định mức độ mẫn cảm với thuốc kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được chúng tôi tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo (Kirbly – Bauer, 1959).
Nguyên lý của phương pháp: Các khoanh giấy đã tẩm kháng sinh đặt lên mặt thạch đã được dàn đều một lớp vi khuẩn cần kiểm tra. Kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch tạo một gradien nồng độ, để tủ ấm 37oC/24 giờ. Đánh giá kết quả qua đường kính vô khuẩn.
Chuẩn bị:
+ Nồng độ vi khuẩn: Dùng que cấy đã vô trùng để lấy mẫu ở các ống effendorf có chứa mẫu vi khuẩn Salmonella. Sau đó tiến hành ria cấy trên môi
trường dinh dưỡng Nutrient agar và giữ ở 370 C trong vòng 12-24 h để thu sinh khối.
Hòa tan sinh khối tế bào vi khuẩn Salmonella trong ống nghiệm có chứa 5ml dung dịch canh thang sao cho mật độ tế bào vi khuẩn Salmonella đạt khoảng 106CFU/ml (bằng cách chuẩn độ), hút 200 µl (1 mẫu/2 đĩa petri) huyền dịch tế bào vi khuẩn Salmonella cấy trải trên môi trường Nutrient agar.
+ Bộ đĩa giấy các loại kháng sinh thông dụng: Streptomycin, Kanamycin, Cefoxitin, Colistin, Tetracycline, Gentamicin, Ampicillin.
Tiến hành:
+ Cấy vi khuẩn: Vortex huyền dịch vi khuẩn trong 30 giây. Lấy 0,2 ml hỗn dịch vi khuẩn láng lên đĩa thạch đã chuẩn bị từ trước, để khô đĩa thạch trong tủ ấm 10 phút trước khi đặt giấy kháng sinh.
+ Đặt khoanh giấy: các khoanh giấy kháng sinh được đặt chắc chắn và cách nhau đều xung quanh đĩa thạch và cách nhau khoảng 20 mm từ cạnh khoanh giấy này đến khoanh giấy khác và 1 khoanh giấy ở trung tâm, có thể đặt 6 khoanh giấy/đĩa.
Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng 30-60 phút cho kháng sinh khuếch tán đồng đều ở thạch, sau đó để úp đĩa và cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24h. Sau đó tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh bảng chuẩn để tính độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại
kháng sinh TT Tên kháng sinh Ký hiệu Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Kháng Trung Bình Nhạy cảm 1 Streptomycin Sm ≤11 12-20 ≥21 2 Kanamycin Kn ≤16 17-25 ≥26 3 Cefoxitin Cn ≤22 23-29 ≥30 4 Colistin Co ≤10 11-17 ≥18 5 Tetracycline Te ≤17 18-25 ≥26
2.3.7. Phương pháp điều trị thử nghiệm trên vịt
Trên cơ sở kết quả kháng sinh đồ, lựa chọn loại kháng sinh mẫn cảm nhất để xây dựng phác đồ và tiến hành điều trị thử nghiệm trên vịt bệnh tại địa phương nghiên cứu, so sánh hiệu quả điều trị của phác đồ thử nghiệm với phác đồ mà thú y cơ sở ở địa phương đang sử dụng.
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được được quản lý bằng phần mềm EXCEL/93, xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học sử dụng phần mềm SPSS (năm 2016).
Số mẫu dương tính
- Tỷ lệ nhiễm (%) = x 100
Số mẫu kiểm tra - Chỉ số trung bình cộng: 1 n i i x X n = =
Trong đó X giá trị trung bình của mẫu có n cá thể quan trắc. - Sai số của số trung bình (SE):
S SE
n
=
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÌNH HÌNH BỆNH DO SALMONELLA TRÊN VỊT NUÔI TẠI HUYỆN
HOÀI NHƠN, TỈNH BÌNH ĐỊNH
Qua điều tra, theo dõi tình hình vịt bị bệnh tiêu chảy có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh do vi khuẩn Salmonella trong 3 tháng cuối năm 2015 và tháng 01 năm 2016 tại 6 xã đại diện cho 3 vùng sinh thái (vùng ngập nước, vùng ven sông, vùng khô) của huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định, chúng tôi thu được kết quả trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tình hình vịt mắc bệnh do Salmonella tại một số xã của huyện Hoài
Nhơn, tỉnh Bình Định Vùng Xã Số vịt điều tra (con) Số vịt mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Số vịt chết (con) Tỷ lệ (%) Ngập nước Hoài Mỹ 8.000 1.934 24,17 286 3,58
Tam Quan Nam 11.400 2.427 21,29 444 3,89
Tổng 19.400 4.361 22,48 730 3,76 Ven sông Hoài Đức 8.400 2.224 26,47 307 3,65 Hoài Thanh 8.800 2.309 26,23 470 5,34 Tổng 17.200 4.533 26,45 777 4,51 Vùng khô Hoài Phú 10.250 1.905 18,58 263 2,56 Hoài Sơn 7.200 1.693 23,51 315 4,37
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết do Salmonella ở vịt nuôi tại huyện Hoài Nhơn, tỉnh Bình Định lần lượt là 23,11% và 3,58%. Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là vịt nuôi ở vùng ven sông (26,45%), tiếp đến là vùng ngập nước (22,48%) và thấp nhất là ở vùng khô với tỷ lệ mắc bệnh là 20,61%. Tỷ lệ vịt chết do Salmonella cũng có xu hướng tương tự: vùng ven sông là 4,51%, vùng ngập
nước là 3,76% và vùng khô là là 3,31%. Tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Qua điều tra khảo sát chúng tôi nhận thấy, những xã có tỷ lệ vịt mắc bệnh cao thường thuộc vùng ven sông, đầu nguồn nước, có tập quán nuôi vịt chăn thả dưới lòng sông nên khi mùa nước cạn vịt dễ bị lây nhiễm mầm bệnh.
Trong thời gian theo dõi chúng tôi nhận thấy bệnh thường phát ra vào thời điểm thời tiết thay đổi đột ngột, mùa đông thời tiết lạnh môi trường ẩm ướt, vệ sinh kém…Điều này cho thấy việc chăm sóc, nuôi dưỡng, quản lý đàn thủy cầm vào thời điểm thời tiết thay đổi, chuyển mùa và trong mùa đông khi nền nhiệt độ thấp là rất cần thiết để hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra.
Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết ở vịt do Salmonella theo từng xã trên địa bàn
nghiên cứu được thể hiện qua các biểu đồ ở Hình 3.1 và 3.2.
Hình 3.2. Biểu đồ tỷ lệ chết ở vịt mắc bệnh do Salmonella tại các xã nghiên cứu
Qua phân tích số liệu theo độ tuổi của vịt chúng tôi cũng nhận thấy, tỷ lệ mắc bệnh do Salmonella ở 2 độ tuổi của vịt (dưới 2 tháng tuổi và từ 2 tháng tuổi trở lên ) cũng có sự khác nhau. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3.