3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.3.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
2.3.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
Đối với mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi phân tích. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ thường sau đó tăng nhiệt độ dần lên 450C trong 15 phút. Cần lắc túi chứa mẫu để tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu.
2.3.4.2. Phương pháp phân lập
Vi khuẩn Salmonella được phân lập theo quy chuẩn ISO 6579:2002, có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Mẫu sau khi xử lý được nuôi cấy, phân lập theo sơ đồ trình bày ở Hình 2.1.
2.3.4.3. Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn
Tiêu bản vi khuẩn được nhuộm bằng phương pháp Gram và xem kính hiển vi với vật kính dầu (10 x 100).
2.3.4.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường KIA để xác định khả năng lên men đường Glucose, Lactose, khả năng sinh H2S và khả năng sinh hơi của vi khuẩn. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra ria đều trên phần thạch nghiêng và cấy chích sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 370C sau 18-24 giờ thì đọc kết quả.
+ Khả năng lên men đường Lactose: Vi khuẩn lên men đường Lactose (dương tính) sẽ làm phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, trường hợp âm tính thì môi trường không đổi màu.
+ Khả năng lên men đường Glucose: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường Glucose (dương tính) thì phần thạch đứng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, ngược lại nếu vi khuẩn không có khả năng lên men đường Glucose (âm tính) thì phần thạch đứng giữ nguyên màu đỏ.
+ Khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi làm thạch bị nứt và bị đẩy lên khỏi đáy ống nghiệm; trường hợp sinh hơi yếu thì trong lòng thạch có bọt khí.
+ Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S thì phần thạch đứng có màu đen. Do H2S được hình thành từ các acid amin chứa lưu huỳnh có trong pepton hoặc Sodiumthiosulphate (Na2S2O3) có trong môi trường, H2S phản ứng với FeSO4 theo phản ứng sau:
H2S + FeSO4 = FeS↓(màu đen) + H2SO4
Kiểm tra khả năng di động (Motility)
Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy. Vi khuẩn không có khả năng di động thì toàn bộ môi trường vẫn trong.
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Urea-Indol
+ Khả năng sinh Ure: Vi khuẩn có men Urease sẽ phân giải Ure thành NH3
làm pH của môi trường thay đổi, khi đó chất chỉ thị màu Phenol red chuyển môi trường sang màu hồng cánh sen.
+ Khả năng sinh Indol: Trong môi trường Urea - Indol có chứa Tryptophan là một acid amin mà một số vi khuẩn có khả năng phân giải và sinh hơi nhờ men Tryptophanaza. Khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào môi trường có cấy vi khuẩn có khả năng phân giải Tryptophan sinh Indol thì trên bề mặt môi trường sẽ xuất hiện vòng màu đỏ.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường citrat
Natri citrat là một muối của acid citric, một hợp chất hữu cơ. Để phát hiện khả năng sử dụng citrat của vi khuẩn người ta nuôi cấy vi khuẩn vào trong môi trường Simmons có natri citrat, đây là phân tử có chứa một anion, cũng là một nguồn carbon duy nhất, ngoài ra trong môi trường còn có (NH4)H2PO4, là một nguồn nitro duy nhất. Nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng citrat từ natri citrat thì sẽ kéo theo sự khử được nitro từ muối amoni với sản phẩm tạo thành là amoni hydroxyd (NH4OH) làm kiềm hoá môi trường, do đó sẽ làm cho chất chỉ thị xanh bromthymol trong môi trường chuyển sang màu xanh nước biển. Trường hợp vi khuẩn không sử dụng citrat thì môi trường không đổi màu.
Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường MR
Một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh các acid mạnh (lactic, acetic, formic…) từ glucose bằng cách lên men, điển hình là vi khuẩn đường ruột với một số loài có thể sản xuất ra đủ một lượng acid mạnh làm cho môi trường nuôi cấy luôn giữ ở pH = 4,4. Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn chỉ cần nhỏ đỏ Methyl (Methyl Red) vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau 48-72 giờ (thường đỏ, còn âm tính thì môi trường có màu vàng.
Kiểm tra khả năng lên men đường Lactose, Glucose và Saccharose
Dấu hiệu thể hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn trong các môi trường đường được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Dấu hiệu thể hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn
Môi trường Âm tính Dương tính
Glucose (lỏng) Đỏ, ống Dulham chìm Vàng, ống Dulham nổi
Kiểm tra khả năng dung huyết
Có 3 dạng dung huyết (Trần Đức Hạnh, 2011): Dạng dung huyết alpha (α), vòng dung huyết hơi trong bao quanh vòng màu xanh lục sát khuẩn lạc. Dạng dung huyết hoàn toàn beta (β), vòng dung huyết trong suốt không màu, có bờ rõ ràng. Dạng gamma (γ), hoàn toàn không dung huyết.