Nuôi cấy nấm là kỹ thuật phức tạp nhằm mục đích phân lập và định loại nấm. Nhìn chung, môi trường phân lập nấm tương đối nghèo chất dinh dưỡng và thường dùng môi trường Sabouraud có một số loại đường. Môi trường định loại nấm là những môi trường thích hợp để nấm phát triển tối đa về hình thể, khuẩn lạc phát triển đầy đủ, bộc lộ những đặc tính giúp cho việc định loại được dễ dàng. Trong phạm vi bài này chỉ giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy nấm trên những môi trường phân lập đơn giản để phát hiện sự có mặt của nấm trong bệnh phẩm sau khi nuôi cấy. Môi trường thường được dùng là Sabouraud đổ đĩa, ưu điểm của các môi trường đĩa là vừa nhận xét được phần mặt và rìa khuẩn lạc, vừa quan sát được phần đáy (mặt sau) khuẩn lạc.
2.1. Môi trường nuôi cấy
Dụng cụ
- Que cấy, đèn cồn.
- Ống nghiệm, đĩa petri vô khuẩn. - Tủ ấm, tủ sấy.
Môi trường
- Môi trường Sabouraud có đường: Pepton: 10g.
Glucose hoặc maltose: 40g. Thạch sợi: 20g.
Nước thường: 1000mL.
- Môi trường Sabouraud để bảo quản: Pepton: 30g.
Thạch sợi: 20g. Nước cất: 1000mL.
- Môi trường Sabouraud có kháng sinh: Pepton: 10g.
Glucose: 20g.
Thạch sợi: 20g. Nước cất: 1000mL.
- Có thể thay thế chloramphenicol bằng: Streptomycin: 40 đơn vị/ 1mL môi trường. Penicillin: 20 đơn vị/ 1mL môi trường.
Các thành phần của từng môi trường được đun nóng để hoà tan các chất, sau đó nếu cần thì cho thêm kháng sinh, hấp ở 115oC trong 10- 15 phút đổ đĩa hoặc ống để nghiêng, bảo quản ở tủ lạnh.
2.2. Điều kiện nuôi cấy
- Tất cả mẫu cấy được ủ ở 300C bởi vì nhiệt độ này thích hợp cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển, nếu không có thể ủ ở nhiệt độ phòng (250C). Trước đây chúng ta thường ủ 4 tuần nhưng một nghiên cứu gần đây cho rằng chỉ cần 3 tuần là đủ cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển, ngoại trừ da, tóc, móng và bệnh phẩm tìm vi nấm nhị độ. Đối với bệnh phẩm tìm nấm men như dịch hầu họng, dịch âm đạo chỉ cần ủ 7 ngày. Nên kiểm tra mẫu cấy ít nhất 2 hoặc 3 ngày mỗi lần trong 2 tuần đầu và hàng tuần trong các tuần tiếp theo.
Khuẩn lạc nấm xuất hiện:
+ Sau 2-5 ngày: thường là nấm men hoặc nấm hoại sinh
+ Sau 1,5 - 2 tháng: nhóm nấm gây bệnh ngoài da, Ví dụ T.schoenleinii
+ Sau 2 tháng không thấy nấm mọc: kết luận âm tính.