Cơ sở khoa học của việc bổ sung men sống (là một probiotic) vào thức ăn cho cá đã cho kết quả tốt về tăng trưởng và tăng sức đề kháng (Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000; Guillaume, 1991; trích dẫn bởi Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000). Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ tập trung vào loài nấm men S. cerevisiae. Trong khi đó, bổ sung men sống của loài nấm men K. marxianus vào thức ăn đã làm thay đổi quần thể vi sinh vật ở ruột heo con cai sữa và ngựa (Bottona và ctv., 2005). Loài vi khuẩn này sinh sản nhanh nhất trong vi sinh vật nhân thật.
Bổ sung nấm men K. marxianus vào thức ăn cho động vật thủy sản chưa
được nghiên cứu. Một số công trình nghiên cứu của các tác giả về bổ sung men sống của loài nấm men S. cerevisiae và D. hansenii trên động vật thủy sản được lược duyệt như sau. Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ việc bổ sung nấm men trong thức ăn có thể tăng cường miễn dịch và nâng cao tốc độ sinh trưởng của cá nuôi (Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000; Guillaume, 1991; trích dẫn bởi Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000). Nấm men (S. cerevisiae) đã được chứng minh có tiềm năng thay thế thức ăn tươi sống cho một số loài cá như cá hồi, cá cam (Nayar và ctv., 1998) và thay thế bột cá (Rumsey và ctv., 1991; Oliva-Teles và Goncalves, 2001). Nấm men (S. cerevisiae) là một thành phần nguyên liệu chế biến thức ăn công nghiệp cho một số loài cá, trong đó có cá hồi (NRC, 1993; được trích bởi Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000). Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men có ảnh hưởng tốt
đến tăng trưởng, khả năng đáp ứng miễn dịch của các đối tượng thủy sản (Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000). Nấm men (S. cerevisiae) bổ sung vào thức ăn có thể nâng cao tốc độ tăng trưởng của cá rô phi (O. niloticus) (Lara-Flores và ctv., 2003). Mức độ hiệu quả còn tùy thuộc vào chủng nấm men, loài thủy sản thí nghiệm. Hoạt động thực bào ở cá rô phi vằn cao hơn khi cá ăn thức ăn có bổ sung nấm men (Engstad và ctv., 1992).
He và ctv. (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng khi bổ sung S. cerevisiae vào thức ăn đối với cá rô phi lai (O. niloticus x O. aureus) với 6 mức 0; 0,125; 0,25; 0,5;
1,0 và 2,0g /kg thức ăn. Kết quả cho thấy mức bổ sung S. cerevisiae tối ưu cho hoạt
động của lysozyme, C3, C4 (yếu tố không bền với nhiệt, tăng cường chức năng tiêu diệt vi khuẩn của huyết thanh (ký hiệu complement là C) và được quy ước là các thành phần của con đường hoạt hóa bổ thể) và hoạt động của đại thực bào lần lượt là 0,226; 0,467; 0,492 và 0,5g/kg thức ăn. Nghiên cứu này cho thấy bổ sung
S. cerevisiae vào thức ăn ảnh hưởng đến quần thể vi khuẩn đường ruột, đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu nhưng không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ
sống.
Reyes-Becerril và ctv. (2008) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm men sống D. hansenii (106 CFU/g) lên các yếu tố và biểu hiện của các gen của đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá Sparus aurata. Sau 2 tuần thí nghiệm, kết quả về hoạt tính của enzyme superoxide dismutase (SOD) của gan tăng so với nghiệm thức đối chứng, tương ứng là 9,77 ± 0,92 và 6,75 ± 0,62 U/mg protein (P < 0,05); nhưng không tăng ở cuối thí nghiệm (sau 4 tuần thí nghiệm) (P > 0,05). Thức ăn có bổ
sung D. hansenii làm giảm biểu hiện các gen ở gan, ruột (trừ C3) và tăng biểu hiện
ở thượng thận của cá S. aurata. D. hansenii có thể kích thích các yếu tố của hệ
thống miễn dịch tự nhiên ở cá S. aurata, đặc biệt ở mức tế bào. D. hansenii tham gia vào hệ vi sinh vật đường ruột của cá. Kết quả này cũng tương tự khi thí nghiệm với ấu trùng cá chẽm Châu Âu, Dicentrarchus labrax (Tovar và ctv., 2002, 2004).
Nấm men (S. cerevisiae) đã được báo cáo về tác dụng tốt với động vật thủy sản khi bổ sung vào thức ăn (Ortũno và ctv., 2002; Lara-Flores và ctv., 2003; Li và Gatlin III, 2003, 2004; Abdel-Tawwab và ctv., 2008; Valeska và ctv., 2010). Bổ
sung S. cerevisiae vào thức ăn cho cá S. aurata với 4 mức 0; 1; 5 và 10 g/kg trong 4 tuần cho thấy nâng cao hoạt động thực bào sau 4 tuần thí nghiệm với mức 5 và 10 g/kg (không có sự sai khác giữa 2 mức này) nhưng không có sự sai khác so với đối chứng ở tuần 1 và 2. Theo báo cáo này, hoạt tính độc tế bào (natural cytotoxic activity) nâng cao ở mức bổ sung 1g/kg thức ăn sau 4 tuần thí nghiệm so với đối chứng (P < 0,05). Theo đó, lượng S. cerevisiae bổ sungtối ưu đối với hệ miễn dịch
tự nhiên của cá S. aurata là 10g/kg thức ăn. Trong thí nghiệm này, lượng S. cerevisiae bổ sung cao cũng không kích thích hệ bổ thể và lysozyme (Ortũno và ctv., 2002). Li và Gatlin III (2003) đã tiến hành thí nghiệm bổ sung nấm men
S. cerevisiae vào thức ăn cho cá Morone chrysops × M. saxatilis với các mức 1%, 2% và 4%. Sau 9 tuần thí nghiệm, tác giả nhận thấy tốc độ tăng trưởng và hiệu quả
sử dụng thức ăn được nâng cao ở cá được ăn thức ăn có S. cerevisiae so với cá ăn thức ăn đối chứng. Một nghiên cứu khác của Li và Gatlin III (2004) cũng với nấm men S. cerevisiae khi bổ sung vào thức ăn cho cá hybrid striped bass với 2 mức 1 và 2%. Theo thí nghiệm này, số lượng bạch cầu trung tính và hàm lượng ion oxi hóa ngoại bào ở cá ăn thức ăn có bổ sung S. cerevisiae cao hơn (P < 0,05) so với cá ăn thức ăn đối chứng. Thí nghiệm cảm nhiễm với vi khuẩn Streptococcus iniae thì tỷ lệ
sống của cá ăn thức ăn có bổ sung S. cerevisiae cao hơn (P < 0,01) so với cá ăn thức
ăn đối chứng.
Andrews và ctv. (2010) đã tiến hành thí nghiệm bổ sung chất chiết nấm men và nấm men trên cá rô hu (Labeo rohita) trong 60 ngày. Kết quả cho thấy hoạt động thực bào, số lượng tế bào bạch cầu, hàm lượng protein và globulin trong huyết thanh cao hơn (P < 0,05) ở nhóm cá ăn thức ăn có 1% chất chiết nấm men so với nhóm cá ăn thức ăn có 1%, 2% và 4% nấm men (S. cerevisiae) và đối chứng. Tốc
độ tăng trưởng không sai khác giữa các nghiệm thức (P > 0,05). Tỷ lệ sống cao nhất cũng ở nhóm cá ăn thức ăn có 1% chất chiết nấm men khi cảm nhiễm với
A. hydrophila.
Theo Abdel-Tawwab và ctv. (2008) bổ sung nấm men từ 1 – 5g/kg thức ăn (các mức thí nghiệm là 0,0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 g/kg thức ăn) vào thức ăn của cá rô phi vằn có trọng lượng trung bình là 0,33g cho tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử
dụng thức ăn tốt nhất sau 12 tuần. Thức ăn có nấm men nâng cao hàm lượng protein trong cơ thể cá. Kết quả gây nhiễm với vi khuẩn A.hydrophila cho thấy tỷ lệ chết thấp nhất ở cá ăn thức ăn có 5 g nấm men/kg và cao nhất ở nghiệm thức đối chứng (P < 0,05). Tổng số cá chết trong 10 ngày giảm (P < 0,05) theo mức tăng lượng nấm
men trong thức ăn. Cá chết nhiều trong 4 ngày đầu sau khi tiêm vi khuẩn. Kết quả
này cũng tương tự như các nghiên cứu bổ sung nấm men vào thức ăn cho cá rô phi (Lara-Flores và ctv., 2003); cá bơn Nhật Bản (Taoke và ctv., 2006); cá mrigal (Swain và ctv., 1996). 1.7. Kluyveromyces marxianus 1.7.1. Hệ thống phân loại Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Kluyveromyces Van der Walt, 1956 Loài: Kluyveromyces marxianus
Tên thông thường: Yeast (Van der Walt, 1970; được trích dẫn bởi Ann và Alessandro, 1987).
Kluyveromyces marxianus là tên khoa học hiện nay thường được sử dụng. Trước đây, chúng được sử dụng với tên là Kluyveromyces fragilis (Arora và ctv., 2004; Nguyễn Phùng Tiến và ctv., 2000).
1.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
K. marxianus là loài tăng trưởng nhanh nhất trong vi sinh vật có nhân thật, chu kì sinh sản khoảng 70 phút (Fonseca và ctv., 2008) trong khi của S. cerevisiae
là 120 phút (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002). Chúng đồng hóa đường lactose, glucose; lên men để sản xuất ethanol (Lane và Morrissey, 2010). K. marxianus là nấm men sản xuất các enzyme tự nhiên nhưβ-galactosidase (Belem và ctv., 1998), inulinase và pectinase, trong đó inulinase không tìm thấy ở các loài nấm men khác (Hong và ctv., 2007; Fonseca và ctv., 2008). K. marxianus có thể phát triển ở 52°C
(Fonseca và ctv., 2008). Nhiệt độ sấy khô K. marxianus là từ 35°C - 60°C (Papapostolou và ctv., 2007).
K. marxianus có thể sinh sản sinh dưỡng bằng cách các tế bào nảy chồi đa cực, đôi khi có khuẩn ty giả. Khi điều kiện sống không thuận lợi, K. marxianus có thể sinh sản hữu tính bằng cách tạo các túi bào tử có thể có hoặc không có sự tiếp hợp. Mỗi túi có 1 - 4 (hoặc > 4) bào tử túi nhẵn, hình ô van, tròn, que hay hình thận. Bào tử túi được phóng ra khi chín (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002).
Bảng 1.6. Đặc điểm sinh lý của K. marxianus
Đặc điểm sinh lý
Lên men +
Đồng hoá nitrat -
Màng trên môi trường dịch thể -/+ Cơ chất giống tinh bột -
Đồng hóa inositol -
Hoạt hoá ureaza -
Hóa lỏng gelatin -
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 02 – 06/2011 tại Trại Thực Nghiệm Thủy Sản của Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM và Trung Tâm Nghiên Cứu Thủy sản của Công ty Novus.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus với tỷ lệ khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức
ăn cá rô phi vằn giống.
2.2.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus đến khả năng miễn dịch và kháng bệnh với vi khuẩn A. hydrophila
của cá rô phi vằn giống.
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Cá thí nghiệm 2.3.1. Cá thí nghiệm
Cá rô phi vằn (O. niloticus) được sử dụng trong nghiên cứu này có trọng lượng trung bình là 6,15g ± 0,10, có nguồn gốc từ trại cá giống Phú Hữu, quận 9, TP.HCM. Cá được nuôi trong các bể composite 0,5 m³ bằng thức ăn công nghiệp trong 2 tuần để kiểm soát bệnh. Sau đó, tuyển chọn những cá khỏe, không dị hình,
Hình 2.1. Hình dạng ngoài của cá lúc bố trí thí nghiệm
2.3.2. Nguồn nước và hệ thống bể thí nghiệm
Nước sử dụng trong thí nghiệm là nước máy, được trữ trong bể chứa có sục khí ít nhất 24 giờ trước khi cấp vào hệ thống tuần hoàn khép kín. Hệ thống tuần hoàn khép kín được sử dụng để thực hiện thí nghiệm gồm 30 bể (80L/bể). Nước vào các bể thí nghiệm sau khi được lọc tại bể lọc sinh học và nước từ hệ thống các bể sẽ
quay lại và được lọc tại bể lọc sinh học. Nước mất do siphon và bay hơi được bổ
sung từ nguồn nước trữ trong bể chứa.
2.3.3. Thức ăn thí nghiệm
Sáu nghiệm thức thức ăn thí nghiệm được phối trộn có hàm lượng protein (32%) và chất béo (6%) như nhau. Thành phần của các thức ăn thí nghiệm được trình bảy tại Bảng 2.1 (trang 20). Nghiệm thức thức ăn 1 không bổ sung nấm men
được coi là nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức thức ăn 2, 3, 4 và 5 lần lượt được bổ sung 0,03%; 0,125%; 0,5% và 2,0% K. marxianus. Nghiệm thức thức ăn 6 được bổ sung 2,0% S. cerevisiae. Nghiệm thức 6 để xem xét ảnh hưởng của K. marxianus
sovới S. cerevisiae – loài nấm men đã được nghiên cứu nhiều trên cá rô phi vằn. Nguyên liệu làm thức ăn được nghiền mịn, cân và sau đó được trộn bằng máy Hobart (Hobart Inc., Troy, Ohio, USA) trong 15 phút, sau đó cho dầu cá và dầu đậu nành vào và trộn trong 15 phút, tiếp theo cho nước ấm (50oC) vào từ từ
có đường kính 2 mm bằng máy đùn (Hobart Inc., Troy, Ohio, USA). Thức ăn được làm khô bằng máy sấy trong 24 giờ ở 60°C và được trữ ở - 4°C đến khi cho ăn. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn thí nghiệm được phân tích tại Trung tâm phân tích Lareal (Bình Dương).
Hình 2.2. Hình ảnh máy trộn (a), máy ép (b) và máy sấy thức ăn thí nghiệm (c)
2.3.4. Vi khuẩn
Vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm là Aeromonas hydrophila của Khoa Thủy sản, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM và được lưu giữ - 20°C tại Trung Tâm Nghiên Cứu Thủy Sản Công ty Novus. Vi khuẩn A. hydrophilađược sử dụng để gây nhiễm cá rô phi vằn sau khi kết thúc thí nghiệm 1.
a b
Bảng 2.1. Thành phần của 6 khẩu phần thức ăn thí nghiệm trên cá rô phi
Thành phần (g/100g)
Nghiệm thức
YE0,0 YE0,03 YE0,125 YE0,5 YE2,0 BY2,0
Bột đậu nành1 46,70 46,70 46,70 46,70 46,70 46,70 Bột khoai mì lát1 13,70 13,68 13,62 13,33 12,53 13,02 Bột gạo1 12,20 12,20 12,20 12,20 12,20 12,20 Bột bã cải1 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 Bột mì1 5,90 5,90 5,90 5,90 5,90 5,90 Bột cá1 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 Protein đậu nành đậm đặc1 2,73 2,73 2,70 2,63 2,00 1,40 Dầu cá1 2,54 2,54 2,54 2,54 2,54 2,54 Dầu đậu nành1 2,53 2,52 2,52 2,50 2,43 2,54 Dicalcium phosphate1 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 Premix khoáng2 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Premix vitamin3 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 K. marxianus 4 0,00 0,03 0,125 0,50 2,00 0,00 S. cerevisiae 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 MHA (Mera Met)6 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Stay C (25%)7 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 Choline chloride7 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 Tổng (g) 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
1Công ty TNHH Quang Duy, Bình Dương
2 Thành phần (g/kg premix) gồm: cobalt chloride 0,074; cupric sulfate pentahydrate 2,5; ferrous sulfate heptahydrate 73,158; magnesium sulfate heptahydrate 283,98; manganous sulfate monohydrate 6,5; potassium iodine 0,68; sodium selenite 0,1; zinc sulfate heptahydrate 131,92; cellulose 501,088
3 Thành phần (g/ kg premix) gồm: Vitamin B1 0,438; Vitamin B2 0,632; Vitamin B6 0,908; axit D-pantothenic, hemicalcium salt 1,724; niacin 4,583; biotin 0,211; axít folic 0,549; vitamin B12 0,001; inositol 21,053; vitamin K 0,889; vitamin A acetate 0,677; vitamin D3 0,116; DL-alphatocopherol- acetate 12,632; cellulose 955,587
4 Công ty Novus
6 Công ty Novus International, Mỹ 7 Công ty Sigma – Aldrich
Hình 2.3. Thức ăn thí nghiệm
2.3.5. Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus với tỷ lệ khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sử dụng
thức ăn cá rô phi vằn giống 2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm sáu nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần (Hình 2.4). Thí nghiệm được tiến hành trong 10 tuần.
Trước khi bố trí cá vào hệ thống, thả cá vào hai bể (20 cá/bể) trong 24 giờ
nhằm kiểm tra chất lượng nước. Sau 24 giờ, quan sát cá hoạt động bình thường thì bố trí cá vào hệ thống. Cá được bố trí ngẫu nhiên vào 30 bể trong hệ thống tuần hoàn với 20 cá/bể, thể tích bể 120 lít (khoảng 80 lít nước). Tốc độ tăng trưởng của cá thí nghiệm được kiểm tra sau mỗi hai tuần nuôi. Ngừng cho cá ăn 24 giờ trước khi cân.
Hình 2.4. Hệ thống bể thí nghiệm 1
Khi thí nghiệm bắt đầu, lấy ngẫu nhiên 50 cá trữ ở -80°C để phân tích thành phần cơ thể. Cuối thí nghiệm, thu ngẫu nhiên 8 cá/bể, trong đó 5 cá được lưu giữở
- 80°C để phân tích thành phần cơ thể và 3 cá để lấy máu phân tích lysozyme, lấy gan để phân tích superoxide dismutase (SOD). Như vậy, mỗi bể thí nghiệm phân tích 3 mẫu lysozyme, 3 mẫu SOD. Số cá còn lại được sử dụng cho thí nghiệm 2.
2.3.5.2. Quản lý và chăm sóc
Oxy hòa tan, nhiệt độ và pH được đo hàng ngày bằng máy DO 3210 (WTW, Mỹ), pH 3210 (WTW, Mỹ); NH3, NO2-, độ kiềm được đo bằng máy quang phổ
Spectro Flex 6600 (WTW, Mỹ) một lần trong tuần. Cá được cho ăn ngày 2 lần vào lúc 8 – 9 giờ và 16 - 17 giờ. Siphon vào lúc 13 giờ. Tốc độ dòng chảy điều chỉnh ở
mức 1lít/phút. Trọng lượng và số cá chết trong quá trình thí nghiệm được ghi lại hàng ngày. Hình 2.6. Sơđồ bố trí thí nghiệm 1 2.3.5.3. Các công thức tính Tỉ lệ sống: X (%) = 100 x (Nf/Ni) Tăng trọng: WG (%) = 100 x [(W2 – W1)/W1] Tốc độ tăng trưởng đặc biệt: SGR (%/ngày) = 100 x [ln (W2) – ln (W1)] /N Hệ số biến đổi thức ăn: FCR = Lượng thức ăn sử dụng (100% vật chất khô)/W Hiệu quả sử dụng protein:
PER = W/Lượng protein trong thức ăn đã sử dụng (100% vật chất khô) Tỷ lệ tích lũy protein: PR (%) = 100 x [(Wf x Pf) - (Wi x Pi)]/(lượng thức ăn sử dụng x Pe) (100% vật chất khô) Trong đó: Ni : số cá bố trí thí nghiệm
Nf : số cá thu hoạch khi kết thúc thí nghiệm W1 : tổng trọng lượng cá bố trí thí nghiệm (g) W2: tổng trọng lượng cá khi kết thúc thí nghiệm (g)
W3: tổng trọng lượng cá chết trong quá trình thí nghiệm (g) W: tăng trọng của cá thí nghiệm (g)