a. Dụng cụ và hóa chất
Sodium phosphate buffer (pH = 7,4)
A: Hòa 331,495 g Na2HPO4.7H2O với 1.250 ml nước cất B: Hòa 7,0098 g NaH2PO4.2H2O với 500 ml nước cất
Trộn 1.150 ml dung dịch A với 190 ml dung dịch B được dung dịch C, điều chỉnh pH = 7,4 bằng cách thêm hoặc bớt dung dịch A và B.
Bradford reagent
Hòa 100 mg coomassive G – 250 với 50 ml methanol, 100 ml H3PO4 và cho thêm nước cất đểđược 1.000 ml dung dịch.
Bovine serum albumin (BSA) 96%
Hòa 1,5 g BSA trong 100 ml PBS được protein chuẩn với nồng độ 14.400
µg/ml.
Assay buffer (10 X): Hoà 3 ml assay buffer với 27 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 2 tháng. Assay buffer có các thành phần 50 mM Tris – HCl, pH 8,0; 0,1 mM axít diethylene triamine pentaacetic (DTPA) và 0,1 mM hypoxanthine.
Sample buffer (10 X): Hòa 2 ml sample buffer (50 mM Tris – HCl, pH 8,0) với 18 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 6 tháng.
Radical detector: Hòa 50 µl radical detector với 19,95 ml assay buffer. Thời gian bảo quản là 2 giờ.
SOD chuẩn (Cayman, Mỹ): Bảo quản trong đá, lọ 100 µl thuộc bộ kit
Xanthine oxidase: Hòa 50 µl với 1,95 ml sample buffer. Dung dịch được giữ trong đá, thời gian bảo quản là 1 giờ.
b. Chuẩn bị mẫu
Nghiền 0,5g gan trong 3ml dung dịch đệm (PBS) đã chuẩn bị ở phần trên (pH = 7,4) trong 30 giây (trong đá).
Ly tâm mẫu gan với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C Lấy phần dịch trong phía trên ra eppendorf mới
Pha loãng mẫu 200 lần bằng PBS, mẫu này dùng để phân tích hàm lượng protein và SOD.
c. Các bước phân tích
Bước 1: Phân tích hàm lượng protein trong mẫu Xây dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn theo Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn
Ký hiệu Nồng độ (µg/ml) BSA (µl) PBS (µl) S0 100 900 1440 S1 500 (S0) 500 720 S2 500 (S1) 500 360 S3 500 ( S2) 500 180 S4 500 (S3) 500 90 S5 500 (S4) 500 45 S6 500 (S5) 500 22,5 S7 500 (S6) 500 11,25 S8 500 (S7) 500 5,625 S9 500 (S8) 500 2,8125 S10 500 (S9) 500 1,40625 S11 500 (S10) 500 0,703125 S12 500 (S11) 500 0,3515625 S13 500 (S12) 500 0,17578125 S14 500 (S13) 500 0,087890625 B (blank) - 1000 0
Đo hàm lượng protein của dung dịch protein chuẩn
Hút 150 µl Bradford /giếng rồi cho 50 µl dung dịch B (blank), S14 đến S1
(Bảng 2.3) vào các giếng tương ứng, ngay sau đó đo quang phổ ở bước sóng 595 nm. Từ số liệu OD thu được, xây dựng phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b (R2
≥ 0,98) (trong đó y là giá trị OD, x là hàm lượng protein (µg/ml)).
Đo hàm lượng protein trong mẫu
Hàm lượng protein trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hàm lượng protein trong dung dịch protein chuẩn, chỉ thay 50 µl của S1 đến S14 bằng mẫu.
Hàm lượng protein trong mẫu được xác định theo công thức 2.1
A = Hàm lượng − = a b y (µg/ml)
protein x độ pha loãng (2.1) Trong đó, y là các giá trị OD của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ số
tự do của phương trình đường chuẩn protein.
Bước 2: Đo hàm lượng SOD
Xây dựng đường chuẩn SOD
Chuẩn bị dung dịch superoxide dismutase (SOD) chuẩn: hòa 20 µl SOD chuẩn (Cayma) với 1,98 ml sample buffer để được SOD gốc. Pha dung dịch SOD chuẩn theo Bảng 2.4 (trang 29).
Đo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn
Hút 200 µl dung dịch radical detector rồi hút 10 µl dung dịch SOD chuẩn từ
S0 đến S6 cho một giếng (A - G) (Hình 2.8); sau đó cho tiếp 20 µl dung dịch xanthine oxidase vào mỗi giếng; sau khi ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng đem đo ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate reader.
Phương trình tuyến tính chuẩn SOD được xác định dựa vào đường tuyến tính chuẩn. Đường tuyến tính chuẩn được xác định dựa vào các tỷ lệ tuyến tính
(linearized rate - LR). Tỷ lệ tuyến tính được tính từ các giá trị hấp thụ quang phổ
theo công thức:
LRo = Aso/ Aso; LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR6 = Aso/ As6
Trong đó: LRo là tỷ lệ tuyến tính của S0; Aso - As6 là giá trị OD của S0đến S6 tương ứng
Phương trình tuyến tính có dạng: y = ax + b (R2 ≥ 0,99) (trong đó x là hoạt
độ SOD (U/ml); y là LR) Bảng 2.4. Bảng SOD chuẩn Eppendorf SOD gốc (µl) Mẫu đệm (sample buffer) (µl) Hoạt độ của SOD (U/ml) S0 0 1.000 0 S1 20 980 0,025 S2 40 960 0,050 S3 80 920 0,100 S4 120 880 0,150 S5 160 840 0,200 S6 200 800 0,250 Đo hoạt độ SOD trong mẫu
Hoạt độ SOD trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn, chỉ thay 10 µl của S0 đến S6 bằng mẫu.
Công thức tính
Hoạt độ của SOD của mẫu được tính dựa vào phương trình tuyến tính chuẩn.
Hoạt độ SOD được tính bởi công thức 2.2
B = Hoạt độ − = a b y (U/ml)
Trong đó, y là các giá trị LR của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ
số tự do của phương trình đường chuẩn SOD
LR của các mẫu gan được tính theo công thức:
LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR30 = Aso/ As30 Aso là giá trị OD của S0ở Bảng 2.4
As1 – As30 là giá trị OD của mẫu gan từ 1 đến 30, tương ứng Hoạt độ SOD theo hàm lượng protein được tính bởi công thức 2.3
SOD (U/µg protein) = B/A (2.3)
(Trong đó A, B lần lượt là hàm lượng protein và SOD trong mẫu)
A – G: mẫu chuẩn; S1 – S41: giếng mẫu