Kết quả thành phần hóa học cơ thể cá được trình bày tại Bảng 3.3. Theo đó, tỷ lệ protein cao nhất là 60,64% ở nghiệm thức 6 và 59,15% là tỷ lệ thấp nhất thuộc nghiệm thức 5 trong sáu nghiệm thức. Chất béo chiếm tỷ lệ cao nhất ở nghiệm thức 4 (24,18%) và thấp nhất ở nghiệm thức 3 (21,04%). Tỷ lệ tro cao nhất và thấp nhất tương ứng với nghiệm thức 3, 4 là 13,98% và 12,94%. Tuy nhiên, sự khác biệt về tỷ
lệ protein, chất béo và tro giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
Bảng 3.3. Thành phần cơ thể cá sau 10 tuần thí nghiệm (% vật chất khô) Nghiệm thức Độẩm (%) Protein (%) Chất béo (%) Tro (%) 1 (YE0,0) 73,38a ± 0,23 59,76a ± 0,44 23,55a ± 1,09 13,03a ± 0,70 2 (YE0,03) 72,80a ± 0,74 59,33a ± 1,18 22,73a ± 1,58 13,43a ± 0,54 3 (YE0,125) 73,08a ± 0,63 59,63a ± 0,74 21,04a ± 1,72 13,98a ± 0,50 4 (YE0,5) 72,01a ± 0,54 59,21a ± 0,66 24,18a ± 0,34 12,94a ± 0,45 5 (YE2,0) 73,08a ± 0,43 59,15a ± 0,78 23,07a ± 1,44 13,80a ± 0,41 6 (BY2,0) 73,37a ± 0,53 60,64a ± 1,02 22,08a ± 0,55 13,49a ± 0,26 Cá đầu thí nghiệm* 76,72 64,22 11,34 19,93 Giá trị P 0,51 0,82 0,56 0,63
Số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± sai số chuẩn (SE) (n = 5, ngoại trừ *). Các giá trị trên cùng một cột nếu chứa các ký tự giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
3.3.4. Hiệu quả sử dụng thức ăn
Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), hiệu quả sử dụng protein (PER) và tỷ lệ
Bảng 3.4. Hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng hấp thụ protein của cá thí nghiệm 1 Nghiệm thức FCR PER PR (%) 1 (YE0,0) 1,46a ± 0,02 1,95a ± 0,03 31,16a ± 0,63 2 (YE0,03) 1,53a ± 0,04 1,88a ± 0,05 30,41a ± 0,41 3 (YE0,125) 1,55a ± 0,06 1,86a ± 0,06 29,96a ± 1,32 4 (YE0,5) 1,55a ± 0,03 1,85a ± 0,03 30,86a ± 0,67 5 (YE2,0) 1,55a ± 0,04 1,84a ± 0,05 29,40a ± 0,78 6 (BY2,0) 1,41a ± 0,03 1,95a ± 0,04 31,75a ± 1,04 Giá trị P 0,051 0,311 0,456
Số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± sai số chuẩn (SE) (n = 5). Các giá trị trên cùng một cột nếu chứa các ký tự giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
Hệ số chuyển đổi thức ăn của các nghiệm thức không khác nhau (P > 0,05). Tuy nhiên, FCR thấp nhất ở nghiệm thức 6 (1,41), kế tiếp là nghiệm thức 1 (1,46) và các nghiệm thức còn lại là như nhau.
Hiệu quả sử dụng protein (PER) trong thức ăn cho biết tăng trọng của cá khi sử dụng 1gram protein thức ăn. Hiệu quả sử dụng protein cũng cao nhất ở nghiệm thức 6 và 1 (1,95) và giảm dần từ nghiệm thức 2, 3, 4, 5. Tuy nhiên, sự khác nhau về PER giữa các nghiệm thức là không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05). Tương ứng, tỷ lệ tích lũy protein cao nhất là 31,75% thuộc nghiệm thức 6 và giảm theo các nghiệm thức 1, 4, 3, 2, 5. Về mặt thống kê, sự khác biệt này không có ý nghĩa (P > 0,05).
3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men (K. marxianus) đến khả năng miễn dịch và đề kháng với bệnh của cá rô phi vằn khi cảm nhiễm với vi khuẩn dịch và đề kháng với bệnh của cá rô phi vằn khi cảm nhiễm với vi khuẩn
A. hydrophila
3.4.1. Hoạt độ của enzyme lysozyme và superoxide dismutase (SOD)
Sau mười tuần thí nghiệm, cá được phân tích hoạt độ của hai enzyme lysozyme trong huyết thanh và SOD trong gan.
3.4.1.1. Lysozyme
Bảng 3.5. Hoạt độ lysozyme và SOD của cá thí nghiệm 1 Nghiệm thức Lysozyme (µg/ml) SOD (U/mg protein) 1 (YE0,0) 6,74a ± 1,46 2,74a ± 0,37 2 (YE0,03) 7,58a ± 1,40 2,30a ± 0,16 3 (YE0,125) 6,24a ± 1,49 2,52a ± 0,33 4 (YE0,5) 5,66a ± 0,78 2,33a ± 0,25 5 (YE2,0) 7,92a ± 1,74 2,30a ± 0,21 6 (BY2,0) 5,60a ± 1,10 2,67a ± 0,19 Giá trị P 0,77 0,74
Số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± sai số chuẩn (SE) (n = 5). Các giá trị trên cùng một cột nếu chứa các ký tự giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
Hoạt độ lysozyme được xác định dựa vào đường chuẩn (Hình 3.9, trang 48). Phương trình đường chuẩn là y = 43,723x với R² = 0,9797. Theo đó, khoảng OD595/OD0 của đường chuẩn lysozyme nằm trong khoảng 0,031 – 0,363. Kết quả
phân tích mẫu cho các giá trị OD595/OD0 nằm trong khoảng 0,057 – 0,319. Như
vậy, hoạt độ lysozyme của các mẫu hoàn toàn nằm trong khoảng đo được theo
đường chuẩn đã xây dựng.
Hoạt độ lysozyme cao nhất là 7,92 µg/ml thuộc nghiệm thức 5 và thấp nhất ở
nghiệm thức 6 (5,60 µg/ml). Hoạt độ lysozyme giảm dần theo các nghiệm thức 2, 1, 3 và 4. Tuy nhiên, sự khác biệt về hoạt độ lysozyme giữa sáu nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả hoạt độ lysozyme được trình bày tại Bảng 3.5.
3.4.1.2. SOD
Định lượng protein trong mẫu là cần thiết để tính được hoạt độ của enzyme SOD trên một đơn vị khối lượng protein (mg). Hơn nữa, định lượng protein còn
giúp điều chỉnh lượng mẫu gan dùng để phân tích sao cho lượng protein trong mẫu nằm trong khoảng đo được bởi đường chuẩn.
Phương trình đường chuẩn protein là y = 0,0077x + 0,3106 (*) (R² = 0,9849) (Hình 3.10, trang 49). Giá trị OD595 của mẫu trong khoảng từ 0,535 đến 0,795 hoàn toàn nằm trong khoảng đo được của đường chuẩn đã xây dựng (0,299 - 0,971). Tức là, giá trị hàm lượng protein của các mẫu đều nằm trong 98,49% tương quan với giá trị OD theo phương trình (*). Hàm lượng protein trong các mẫu đã pha loãng 200 lần dao động trong khoảng 41,12 – 46,81 µg/ml. Hàm lượng protein trung bình thực trong các mẫu dao động từ 8.223,38 – 9.361,04 µg/ml, cao nhất ở nghiệm thức 2 và thấp nhất ở nghiệm thức 6 (P > 0,05).
Hình 3.9. Đường chuẩn lysozyme
Phương trình đường chuẩn hoạt độ enzyme SOD là y = 8,0372x + 0,953 (R² = 0,9968) (Hình 3.11, trang Error! Bookmark not defined.). Giá trị OD450 của các hoạt độ SOD (U/ml) chuẩn trong khoảng 0,131 – 0,393. Giá trị OD450 của mẫu
đều nằm trong khoảng tương quan với đường chuẩn (0,180 – 0,249). Hoạt độ SOD
được quy đổi từ đơn vị U/ml sang U/mg protein. Theo đó, hoạt độ SOD trong khoảng 2,30 – 2,74 U/mg protein, cao nhất ở nghiệm thức 1, thấp nhất ở nghiệm
thức 2 và giảm dần theo các nghiệm thức từ 6, 3, 4, 5 (P > 0,05). Kết quảđược trình bày tại Bảng 3.5.
Hình 3.10. Đường chuẩn protein
Hình 3.11. Đường chuẩn SOD
Tóm lại, hoạt độ của hai enzyme lysozyme và SOD được xác định dựa vào
rất cao (97,97; 98,49; 99,68%) và khoảng OD cũng đều nằm trong khoảng xác định
được của đường chuẩn. Mặc dù hoạt độ lysozyme và SOD có khác nhau giữa các nghiệm thức nhưng sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
3.4.2. Kết quả cảm nhiễm cá thí nghiệm với vi khuẩn A. hydrophila
3.4.2.1. Tỷ lệ sống
Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn A.hydrophila trên cá rô phi vằn tiến hành trong thời gian 21 ngày. Cá bắt đầu chết sau năm ngày cảm nhiễm. Những cá sắp chết có hiện tượng bơi lờđờ trên mặt nước, rụng vẩy, mất nhớt, khô ráp, mắt bị lồi
đục, bụng chướng to, vây đuôi bịăn mòn, xuất huyết ở da (Hình 3.12, trang 51). Tỷ lệ sống của cá trong thí nghiệm 2 được trình bày tại Bảng 3.6 và Hình 3.13 (trang 51). Theo đó, tỷ lệ sống của cá thấp nhất ở nghiệm thức 1 (53,33%), cao nhất là 90% thuộc nghiệm thức 2 và 5. Tỷ lệ này giảm dần từ nghiệm thức 3, 4 đến 6. Kết quả phân tích thống kê cho thấy tỷ lệ sống của nghiệm thức 1 có sự khác biệt so với nghiệm thức 2 và 5 (P < 0,05) nhưng không khác biệt so với các nghiệm thức 3, 4 và 6. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa nghiệm thức 2, 5 so với 3, 4 và 6 không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Bảng 3.6. Tỷ lệ sống của cá sau 21 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%) 1 (YE0,0) 53,33b ± 3,33 2 (YE0,03) 90,00a ± 5,77 3 (YE0,125) 86,67ab ± 6,67 4 (YE0,5) 76,67ab ± 8,82 5 (YE2,0) 90,00a ± 5,77 6 (BY2,0) 70,00ab ± 11,55 Giá trị P 0,03
Số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± sai số chuẩn (SE) (n = 3). Các giá trị trên cùng một cột nếu chứa các ký tự giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05).
Hình 3.12. Dấu hiệu bệnh của cá ở thí nghiệm 2
Hình 3.13. Tỷ lệ sống của cá sau 21 ngày cảm nhiễm với vi khuẩn 40 50 60 70 80 90 100 1 4 7 10 13 16 19 22 T ỷ l ệ s ố ng % Thời gian (ngày) YE 0.0 YE 0.03 YE 0.125 YE 0.5 YE 2.0 BY 2.0 a a ab ab ab b
3.4.2.2. Kết quảđịnh danh vi khuẩn sau thí nghiệm
Chúng tôi đã quan sát hoạt động hàng ngày của cá thí nghiệm. Theo đó, ngẫu nhiên lấy ba cá có dấu hiệu bệnh và gần chết để tái định danh vi khuẩn. Cá được vệ
sinh sạch bằng cồn 70%, sau đó phân lập vi khuẩn từ thận, vây đuôi và vết lở loét ở
da.
Kết quảđịnh danh vi khuẩn ở ba cá bị bệnh đều là A. hydrophila. Ba cơ sởđể
chúng tôi khẳng định. Thứ nhất, khi phân lập với môi trường Mac (MacConkey agar) cho các khuẩn lạc giống nhau – thể hiện những vi khuẩn đó thuộc Gram âm (-); khi cấy trên môi trường TSA cho các khuẩn lạc giống về hình dạng, kích thước. Thứ hai, khi cấy trên môi trường Aeromonas isolation agar cho các khuẩn lạc giống nhau, màu xanh đen và có tâm màu đen – đúng với các đặc điểm mô tả của Nhà sản xuất môi trường này (Sigma). Thứ ba, kiểm tra sinh hóa theo bộ kít Api 20E (Biomérieux, Pháp) và bộ kít Oxidase (Công ty Nam Khoa, Việt Nam), kết quả cho thấy các đặc điểm có trong bộ kít đều giống với các đặc điểm của A. hydrophila
(Whitman, 2004).
Kết quả kiểm tra sinh hóa theo bộ kít Api 20E được trình bày tại Bảng 3.7. Ngoài ra, kết quả kiểm tra OF (oxidative/fermentative) cũng cho thấy vi khuẩn này có khả năng lên men đường glucose ở cả điều kiện hiếu khí và yếm khí. Kết quả
kiểm tra cho thấy vi khuẩn này cũng có khả năng oxi hóa (bộ kít Oxidase). Hơn nữa, vi khuẩn cho phản ứng dương tính với H2S và có khả năng di động khi cấy trên môi trường SIM (The sulfide, indole, motility) (Hình 3.14.A). Vi khuẩn cũng được cấy trên môi trường TSI (Triple sugar iron), kết quả cho thấy chúng có khả năng lên men đường lactose và/hoặc sucrose (Hình 3.14.C). Kết quả trên giống với kiểm tra theo bộ kít Api 20E.
Hình 3.14. Hình ảnh khuẩn lạc và phân tích sinh hóa vi khuẩn
A – Cấy vi khuẩn trên môi trường SIM (sự hiện diện của H2S đã cho kết tủa màu đen; quan sát thấy sự phát triển của vi khuẩn lan ra hai bên đường cấy).
B – Cấy vi khuẩn trên môi trường OF (sự chuyển màu từ xanh sang vàng của môi trường cho thấy đã có quá trình lên men đường).
C – Cấy vi khuẩn trên môi trường TSI (mặt nghiêng và đáy của thạch đều màu vàng chứng tỏ có hiện tượng sử dụng đường lactose và/hoặc suctose)
Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra sinh hóa vi khuẩn*( Whitman, 2004)
Đặc điểm của A.hydrophila Kết quả kiểm tra sinh hóa
Quan sát
Oxidative/fermentative +/+ +/+
Gelatinase + +
Sodium pyruvate (VP) + + Màu hồng
Vận động + + Lan ra 2 bên
H2S V + Kết tủa màu đen
Tryptophanase V + Nâu đỏ
2-nitrophenyl-βD-
galactopyranoside (ONPG) + + Vàng
Arginine dihydrolase V + Cam
Lysine decarboxylase V + Cam
Ornithine decarboxylase V - Vàng
Triple sugar iron K/A, A/A** A/A *
Urease - - Vàng
Tryptophane deaminase (TDA) V - Vàng
Amygdalin V + Vàng Arabinose V - Xanh Glucose + + Vàng Lactose V + TSI Inositol V - Xanh Mannitol + + Vàng Melibiose - - Xanh Rhamnose V - Xanh Sorbitol V - Xanh Sucrose V + vàng
* Kết quả kiểm tra sinh hóa của ba cá bệnh ở cả thận, vây đuôi, vết lở loét ở da (kết quả
giống nhau).
** A = axít; K = kiềm; A/A thể hiện có lên men lactose và/hoặc suctose; K/A ký hiệu của
sự có lên men glucose (Whitman, 2004)
Tóm lại: Kết quả tái định danh cho thấy vi khuẩn A. hydrophila có trong quần đàn cá thí nghiệm với tỷ lệ cao. Cá chết có thể là do A. hydrophila.
3.5. Thảo luận
Cá thí nghiệm là những con khỏe, không dị hình dị tật, trọng lượng ban đầu của cá ở các nghiệm thức là như nhau. Chúng được bố trí ngẫu nhiên vào sáu nghiệm thức. Trong quá trình thí nghiệm, điều kiện môi trường nước được duy trì trong khoảng tối ưu cho sự tăng trưởng của cá rô phi vằn. Kết quả phân tích thành phần sinh hóa của thức ăn thí nghiệm cho thấy các thành phần dinh dưỡng tương
đối đồng đều giữa các nghiệm thức, ngoại trừ nghiệm thức 6 có hàm lượng chất béo và protein cao hơn các nghiệm thức còn lại nhưng không có sự khác nhau về mặt thống kê (P > 0,05). Hiện tượng này có thể là do thiết lập công thức thức ăn trên phần mềm Brill có sai số. Nhìn chung, bổ sung nấm men (K.marxianus hoặc S. cerevisiae) vào thức ăn là yếu tốảnh hưởng chính đến kết quả thí nghiệm.
Nghiên cứu này là thử nghiệm đầu tiên về việc bổ sung K.marxianus vào thức ăn cho cá rô phi vằn nói riêng và động vật thủy sản nói chung. Vì vậy chúng tôi xin được thảo luận kết quả nghiên cứu này với kết quả các nghiên cứu có bổ
sung men sống (nấm men S. cerevisiae) vào thức ăn cho cá rô phi vằn và một số
loài cá khác.
Thí nghiệm xem xét ảnh hưởng của việc bổ sung men sống (K. marxianus) vào thức ăn đến tăng trưởng của cá rô phi vằn được tiến hành trong 10 tuần là hợp lý. Theo tổng kết của Nayak (2010), thí nghiệm bổ sung probiotic trong thức ăn của
động vật thủy sản tiến hành trong thời gian từ 1 – 10 tuần. Cho ăn thức ăn có bổ
sung probiotic là phương pháp hiệu quả nhất để phát triển hệ vi sinh vật đường ruột có lợi cho động vật thủy sản (Rengpipat và ctv., 1998; Robertson và ctv., 2000). Thật vậy, ảnh hưởng của probiotic đã được nghiên cứu trên nhiều loài thủy sản bởi những lợi ích của chúng như một chiến lược kiểm soát mầm bệnh và khả năng nâng cao đáp ứng miễn dịch tự nhiên (Irianto và ctv., 2002; Salinas và ctv., 2005). Ảnh hưởng của probiotic mà cụ thể là men sống đến tăng trưởng trên cá còn có nhiều kết
quả khác nhau. Chất lượng của men sống đóng vai trò rất quan trọng, là yếu tố ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu.
Tỷ lệ sống của các nghiệm thức thí nghiệm đều đạt tỷ lệ cao (≥ 90%) và không có sự sai khác giữa các nghiệm thức về mặt thống kê (P > 0,05), chứng tỏ bổ
sung nấm men (K. marxianus) với các mức của thí nghiệm không làm ảnh hưởng
đến tỷ lệ sống của cá. Kết quả thí nghiệm này tương tự với kết quả nghiên cứu việc bổ sung nấm men S. cerevisiae vào thức ăn cho cá rô phi vằn (Abdel-Tawwab và ctv., 2008); cá rô phi lai (O. niloticus x O. aureus) (He và ctv., 2009). Tuy nhiên, Lara-Flores và ctv. (2003) cho rằng bổ sung S. cerevisiae vào thức ăn có thể nâng cao tỷ lệ sống của cá rô phi vằn.
Men sống có khả năng sản sinh các men tiêu hóa giúp các loài vật nuôi tăng cường khả năng tiêu hóa; tiết ra một số hóa chất ức chế vi sinh vật có hại phát triển trong ống tiêu hóa (Hertrampf và Piedad-Pascual, 2000; trích dẫn bởi Lê Thanh Hùng, 2008). Đây cũng có thể là các hướng tác động của men sống giúp cá nuôi tăng trưởng tốt hơn. Kết quả thí nghiệm của Abdel-Tawwab và ctv. (2008) khi bổ
sung S. cerevisiae vào thức ăn cho cá rô phi vằn đã cho tốc độ tăng trưởng nhanh hơn so với đối chứng (P < 0,05), cá chép (Mohanty và ctv., 1996), cá bơn Nhật Bản (Taoka và ctv., 2006). Tuy nhiên, trên cá rô phi vằn kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho tốc độ tăng trưởng khác nhau không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (P > 0,05) nhưng xu hướng cao hơn ở nghiệm thức có bổ sung nấm men (K. marxianus) với mức 0,03%. Tốc độ tăng trưởng đặc biệt (SGR) của cá rô phi vằn trong nghiên cứu này khoảng 3,49 – 3,62%/ngày. Kết quả của Lara-Flores và ctv. (2003) khi bổ sung S. cerevisiae vào thức ăn cho loài cá rô phi vằn (kích cỡ cá rô phi khi bố trí và kết thúc thí nghiệm là 0,15 - 6g) có tốc độ tăng trưởng đặc biệt là từ
5,24 – 5,80 %/ngày và trong khoảng 3,760 – 4,098 %/ngày (kích cỡ cá rô phi khi bố
trí và kết thúc thí nghiệm là 0,33 và 10g) (Abdel-Tawwab và ctv., 2008). Cá thí