Oxy hòa tan, nhiệt độ và pH được đo hàng ngày bằng máy DO 3210 (WTW, Mỹ), pH 3210 (WTW, Mỹ); NH3, NO2-, độ kiềm được đo bằng máy quang phổ
Spectro Flex 6600 (WTW, Mỹ) một lần trong tuần. Cá được cho ăn ngày 2 lần vào lúc 8 – 9 giờ và 16 - 17 giờ. Siphon vào lúc 13 giờ. Tốc độ dòng chảy điều chỉnh ở
mức 1lít/phút. Trọng lượng và số cá chết trong quá trình thí nghiệm được ghi lại hàng ngày. Hình 2.6. Sơđồ bố trí thí nghiệm 1 2.3.5.3. Các công thức tính Tỉ lệ sống: X (%) = 100 x (Nf/Ni) Tăng trọng: WG (%) = 100 x [(W2 – W1)/W1] Tốc độ tăng trưởng đặc biệt: SGR (%/ngày) = 100 x [ln (W2) – ln (W1)] /N Hệ số biến đổi thức ăn: FCR = Lượng thức ăn sử dụng (100% vật chất khô)/W Hiệu quả sử dụng protein:
PER = W/Lượng protein trong thức ăn đã sử dụng (100% vật chất khô) Tỷ lệ tích lũy protein: PR (%) = 100 x [(Wf x Pf) - (Wi x Pi)]/(lượng thức ăn sử dụng x Pe) (100% vật chất khô) Trong đó: Ni : số cá bố trí thí nghiệm
Nf : số cá thu hoạch khi kết thúc thí nghiệm W1 : tổng trọng lượng cá bố trí thí nghiệm (g) W2: tổng trọng lượng cá khi kết thúc thí nghiệm (g)
W3: tổng trọng lượng cá chết trong quá trình thí nghiệm (g) W: tăng trọng của cá thí nghiệm (g)
W (g) = W2 – W1 + W3 N: Số ngày thí nghiệm
Wf: tổng trọng lượng (tính theo vật chất khô) cá khi kết thúc thí nghiệm Wi: tổng trọng lượng (tính theo vật chất khô) cá bố trí thí nghiệm Pf: % protein (100% vật chất khô) của cá kết thúc thí nghiệm Pi: % protein (100% vật chất khô) của cá bố trí thí nghiệm Pe : % protein (100% vật chất khô) của thức ăn thí nghiệm
2.3.5.4. Phương pháp phân tích thành phần cơ thể cá
Hàm lượng protein được phân tích theo phương pháp chuẩn (AOAC., 2000). Các chỉ tiêu khác như chất béo, độ ẩm và tro cũng được phân tích theo AOAC (2000).
Chuẩn bị mẫu cá để phân tích thành phần cơ thể: Lấy cá được lưu giữ - 80°C (cá kết thúc thí nghiệm và cá trước khi thí nghiệm) nghiền mịn bằng máy ST – 04A (Trung Quốc) trong 6 phút. Mẫu cá đã nghiền được đóng túi với lượng 100g/bể
và được giữở - 80°C đến khi gửi đi phân tích. Các mẫu cá được gửi phân tích tại Trung tâm phân tích Lareal.
2.3.5.5. Phương pháp lấy máu cá để thu huyết thanh
Ngừng cho cá ăn 24 giờ trước khi lấy máu. Thu máu bằng kim tiêm G23 ở động mạch đuôi. Huyết thanh thu được sau khi ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút ở
4oC) được bảo quản ở - 80°C để phân tích hoạt độ lysozyme.
2.3.5.6. Phương pháp phân tích lysozyme a. Dụng cụ và hóa chất phân tích a. Dụng cụ và hóa chất phân tích
Vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus 0,75 mg/ml (Sigma) Lysozyme lòng trắng trứng 10 mg/ml (Sigma)
Dung dịch đệm sodium phosphate (PBS) 0,1M (pH = 6,4) Máy ly tâm, microplate reader
Hình 2.7. Máy microplate reader
b. Bước 1: Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn theo Bảng 2.2 (trang 26).
Pha loãng dung dịch lysozyme gốc (nồng độ 1 mg/ml) bằng 9 eppendorf với 2 eppendorf liên tiếp nhau có nồng độ lysozyme lệch nhau 2 lần.
Cho 20 µl dung dịch lysozyme chuẩn vào 200 µl dung dịch vi khuẩn
M. lysodeikticus, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ Bio – Rad. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Giá trị delta OD (∆OD) được tính theo công thức sau:
∆OD = OD0 - OD15 và x = ∆OD/OD0
Dựa vào nồng độ lysozyme lòng trắng trứng của dung dịch chuẩn và giá trị x
để vẽđồ thịđường chuẩn có phương trình y = ax + b (với điều kiện R2≥ 0,97).
Bảng 2.2. Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn Ký hiệu Dung dịch lysozyme (µl) PBS (µl) Nồng độ (mg/ml) S0 100 900 1 S1 500 (S0) 500 1/21 S2 500 (S1) 500 1/22 S3 500 (S2) 500 1/23 S4 500 (S3) 500 1/24 S5 500 (S4) 500 1/25 S6 500 (S5) 500 1/26 S7 500 (S6) 500 1/27 S8 500 (S7) 500 1/28 S9 500 (S8) 500 1/29
c. Bước 2: Đo hoạt tính lysozyme trong mẫu huyết thanh
Cho 20 µl huyết thanh vào 200 µl dung dịch vi khuẩn M. lysodeikticus, đo
độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ. Ủ hỗn hợp ở
nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh được tính dựa trên phương trình đã được xây dựng ở
2.3.5.7. Phương pháp phân tích SOD a. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Sodium phosphate buffer (pH = 7,4)
A: Hòa 331,495 g Na2HPO4.7H2O với 1.250 ml nước cất B: Hòa 7,0098 g NaH2PO4.2H2O với 500 ml nước cất
Trộn 1.150 ml dung dịch A với 190 ml dung dịch B được dung dịch C, điều chỉnh pH = 7,4 bằng cách thêm hoặc bớt dung dịch A và B.
Bradford reagent
Hòa 100 mg coomassive G – 250 với 50 ml methanol, 100 ml H3PO4 và cho thêm nước cất đểđược 1.000 ml dung dịch.
Bovine serum albumin (BSA) 96%
Hòa 1,5 g BSA trong 100 ml PBS được protein chuẩn với nồng độ 14.400
µg/ml.
Assay buffer (10 X): Hoà 3 ml assay buffer với 27 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 2 tháng. Assay buffer có các thành phần 50 mM Tris – HCl, pH 8,0; 0,1 mM axít diethylene triamine pentaacetic (DTPA) và 0,1 mM hypoxanthine.
Sample buffer (10 X): Hòa 2 ml sample buffer (50 mM Tris – HCl, pH 8,0) với 18 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 6 tháng.
Radical detector: Hòa 50 µl radical detector với 19,95 ml assay buffer. Thời gian bảo quản là 2 giờ.
SOD chuẩn (Cayman, Mỹ): Bảo quản trong đá, lọ 100 µl thuộc bộ kit
Xanthine oxidase: Hòa 50 µl với 1,95 ml sample buffer. Dung dịch được giữ trong đá, thời gian bảo quản là 1 giờ.
b. Chuẩn bị mẫu
Nghiền 0,5g gan trong 3ml dung dịch đệm (PBS) đã chuẩn bị ở phần trên (pH = 7,4) trong 30 giây (trong đá).
Ly tâm mẫu gan với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C Lấy phần dịch trong phía trên ra eppendorf mới
Pha loãng mẫu 200 lần bằng PBS, mẫu này dùng để phân tích hàm lượng protein và SOD.
c. Các bước phân tích
Bước 1: Phân tích hàm lượng protein trong mẫu Xây dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn theo Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn
Ký hiệu Nồng độ (µg/ml) BSA (µl) PBS (µl) S0 100 900 1440 S1 500 (S0) 500 720 S2 500 (S1) 500 360 S3 500 ( S2) 500 180 S4 500 (S3) 500 90 S5 500 (S4) 500 45 S6 500 (S5) 500 22,5 S7 500 (S6) 500 11,25 S8 500 (S7) 500 5,625 S9 500 (S8) 500 2,8125 S10 500 (S9) 500 1,40625 S11 500 (S10) 500 0,703125 S12 500 (S11) 500 0,3515625 S13 500 (S12) 500 0,17578125 S14 500 (S13) 500 0,087890625 B (blank) - 1000 0
Đo hàm lượng protein của dung dịch protein chuẩn
Hút 150 µl Bradford /giếng rồi cho 50 µl dung dịch B (blank), S14 đến S1
(Bảng 2.3) vào các giếng tương ứng, ngay sau đó đo quang phổ ở bước sóng 595 nm. Từ số liệu OD thu được, xây dựng phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b (R2
≥ 0,98) (trong đó y là giá trị OD, x là hàm lượng protein (µg/ml)).
Đo hàm lượng protein trong mẫu
Hàm lượng protein trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hàm lượng protein trong dung dịch protein chuẩn, chỉ thay 50 µl của S1 đến S14 bằng mẫu.
Hàm lượng protein trong mẫu được xác định theo công thức 2.1
A = Hàm lượng − = a b y (µg/ml)
protein x độ pha loãng (2.1) Trong đó, y là các giá trị OD của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ số
tự do của phương trình đường chuẩn protein.
Bước 2: Đo hàm lượng SOD
Xây dựng đường chuẩn SOD
Chuẩn bị dung dịch superoxide dismutase (SOD) chuẩn: hòa 20 µl SOD chuẩn (Cayma) với 1,98 ml sample buffer để được SOD gốc. Pha dung dịch SOD chuẩn theo Bảng 2.4 (trang 29).
Đo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn
Hút 200 µl dung dịch radical detector rồi hút 10 µl dung dịch SOD chuẩn từ
S0 đến S6 cho một giếng (A - G) (Hình 2.8); sau đó cho tiếp 20 µl dung dịch xanthine oxidase vào mỗi giếng; sau khi ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng đem đo ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate reader.
Phương trình tuyến tính chuẩn SOD được xác định dựa vào đường tuyến tính chuẩn. Đường tuyến tính chuẩn được xác định dựa vào các tỷ lệ tuyến tính
(linearized rate - LR). Tỷ lệ tuyến tính được tính từ các giá trị hấp thụ quang phổ
theo công thức:
LRo = Aso/ Aso; LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR6 = Aso/ As6
Trong đó: LRo là tỷ lệ tuyến tính của S0; Aso - As6 là giá trị OD của S0đến S6 tương ứng
Phương trình tuyến tính có dạng: y = ax + b (R2 ≥ 0,99) (trong đó x là hoạt
độ SOD (U/ml); y là LR) Bảng 2.4. Bảng SOD chuẩn Eppendorf SOD gốc (µl) Mẫu đệm (sample buffer) (µl) Hoạt độ của SOD (U/ml) S0 0 1.000 0 S1 20 980 0,025 S2 40 960 0,050 S3 80 920 0,100 S4 120 880 0,150 S5 160 840 0,200 S6 200 800 0,250 Đo hoạt độ SOD trong mẫu
Hoạt độ SOD trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn, chỉ thay 10 µl của S0 đến S6 bằng mẫu.
Công thức tính
Hoạt độ của SOD của mẫu được tính dựa vào phương trình tuyến tính chuẩn.
Hoạt độ SOD được tính bởi công thức 2.2
B = Hoạt độ − = a b y (U/ml)
Trong đó, y là các giá trị LR của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ
số tự do của phương trình đường chuẩn SOD
LR của các mẫu gan được tính theo công thức:
LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR30 = Aso/ As30 Aso là giá trị OD của S0ở Bảng 2.4
As1 – As30 là giá trị OD của mẫu gan từ 1 đến 30, tương ứng Hoạt độ SOD theo hàm lượng protein được tính bởi công thức 2.3
SOD (U/µg protein) = B/A (2.3)
(Trong đó A, B lần lượt là hàm lượng protein và SOD trong mẫu)
A – G: mẫu chuẩn; S1 – S41: giếng mẫu
2.3.6. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus đến khả năng kháng bệnh với vi khuẩn A. hydrophila của cá rô
phi vằn giống
2.3.6.1. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Hệ thống bể thí nghiệm 2
Kết thúc thí nghiệm 1, cá thuộc cùng một nghiệm thức thí nghiệm được phân bố ngẫu nhiên vào 3 bể (40 L/bể) với mật độ 10 cá/bể. Cá được chăm sóc và theo dõi tương tự thí nghiệm 1 trong 6 ngày trước khi cảm nhiễm với vi khuẩn
A. hydrophila.
Cá được gây bệnh bằng phương pháp ống thông dạ dày với mật độ vi khuẩn là 1010 CFU/ml hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn.
2.3.6.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Quy trình nuôi cấy vi khuẩn
- Lấy dung dịch vi khuẩn gốc cấy trên môi trường TSA, sau đó ủđĩa 12 giờở
30°C.
- Lấy 1 khuẩn lạc (rời) cho vào ống nhựa 50 ml (fancol) có 30 ml môi trường Tryptic Soy broth (TSB), ủ và lắc 215 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C trong 12 giờ. Sau
đó chia đều lượng vi khuẩn trên vào ba bình tam giác 500 ml có 300 ml TSB rồi ủ, lắc với nhiệt độ và thời gian giống như trên. Sau đó tiếp tục chuyển lượng vi khuẩn
trên vào ba bình tam giác 1.000 ml có 500 ml TSB với điều kiện và thời gian ủ như
trên.
- Tiếp theo, hỗn hợp vi khuẩn – môi trường trên được ly tâm với tốc độ 1.300 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C để lấy hỗn hợp đậm đặc.
- Xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đổ đĩa petri với môi trường TSA. Hút 1 ml hỗn hợp vi khuẩn – môi trường đã được ly tâm trộn đều rồi cho vào
ống nghiệm có 9 ml nước muối sinh lý tiệt trùng (NaCl 0,85%) và pha loãng đến hệ
số 10-10. Lấy 100 µl dung dịch huyền phù vi khuẩn ở mỗi độ pha loãng 10-7, 10-8, 10-9,10-10 cho một đĩa petri, thực hiện với ba đĩa petri cho một độ pha loãng. Đếm khuẩn lạc sau khi ủđĩa petri trong 12 giờở 30°C. Giá trị khuẩn lạc trung bình của ba đĩa petri là căn cứ xác định mật độ vi khuẩn theo công thức:
Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) = (Số khuẩn lạc trung bình x độ pha loãng) / 0,1 ml
2.3.6.3. Chuẩn bị hỗn hợp thức ăn – vi khuẩn
Thức ăn được sử dụng để trộn với vi khuẩn là thức ăn tương ứng với 6 nghiệm thức của thí nghiệm 1 (Bảng 2.1, trang 20). Mỗi nghiệm thức lấy 5 g thức
ăn nghiền mịn. Hỗn hợp thức ăn – vi khuẩn được chuẩn bị theo Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Chuẩn bị hỗn hợp thức ăn – vi khuẩn Nghiệm thức Thể tích dung dịch vi khuẩn (ml) Khối lượng thức ăn (g) Thể tích hỗn hợp thức ăn – vi khuẩn (ml) Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) Liều sử dụng (CFU/cá) YE0,0 8 5 10 1010 0,2 x 1010 YE0,03 8 5 10 1010 0,2 x 1010 YE0,125 8 5 10 1010 0,2 x 1010 YE0,5 8 5 10 1010 0,2 x 1010 YE2,0 8 5 10 1010 0,2 x 1010 BY2,0 8 5 10 1010 0,2 x 1010
Cảm nhiễm cá với A. hydrophila
Ngừng cho cá ăn 24 giờ trước khi cảm nhiễm với vi khuẩn. Bơm 0,2 ml dung dịch thức ăn - vi khuẩn vào sâu trong miệng cá (khoảng 1,5 cm) bằng ống bơm tiêm 3 ml (1 ống bơm tiêm dùng cho 15 cá). Sau đó cá được thả lại vào bể.
Chăm sóc cá được thực hiện tương tự thí nghiệm 1. Cho cá ăn 2 lần/ngày theo đúng nghiệm thức và lượng nước thay hàng ngày là 20%. Tỷ lệ cá chết được theo dõi 2 lần/ngày trong 21 ngày.
Tỷ lệ chết tích lũy (%) = 100 x (tổng số cá chết/số cá ban đầu)
Phương pháp định danh vi khuẩn
Trong 6 nghiệm thức, lấy ngẫu nhiên ba cá đang hấp hối để phân lập và tái
định danh vi khuẩn. Cá được vệ sinh bằng cồn 70% (Alcohol 70%) rồi dùng que cấy tròn lấy vi khuẩn tại vết lở loét ở da, vây đuôi và thận. Sau đó cấy ria trên đĩa petri với môi trường TSA, MacConkey agar (Mac) và Aeromonas isolation agar, lặp lại 3 lần với mỗi môi trường. Ủ các đĩa petri 12 giờ ở 30°C. Định danh vi khuẩn bằng bộ kit Api 20E (Biomérieux, Pháp).
2.3.7. Phương pháp phân tích thống kê
Tất cả các số liệu thu thập được sau thí nghiệm sẽđược phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Minitab 16, sử dụng one – way ANOVA, so sánh trung bình bằng trắc nghiệm Tukey.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Các thông số cơ bản về chất lượng nước trong hệ thống thí nghiệm
Cá nuôi trong thí nghiệm ít bị stress nhất là mục tiêu hàng đầu của người nghiên cứu. Thật vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của nấm men (K. marxianus) đến tăng trưởng, tỷ lệ sống, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng miễn dịch của cá rô phi vằn giống nên sựảnh hưởng của các yếu tố khác là không mong muốn. Nếu như cá thí nghiệm bị stress bởi chất lượng nước thì kết quả nghiên cứu không chính xác. Vậy nên, quản lý thí nghiệm nhằm tạo được điều kiện sống thích hợp nhất cho cá là rất quan trọng. Quản lý môi trường nước thí nghiệm là một yếu tố tiên quyết quyết định sự thành công của nghiên cứu.
Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã theo dõi hàng ngày các thông số
môi trường cơ bản như nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan (DO), pH. Đồng thời, hàm lượng ammonia tổng cộng và NO2- cũng như độ kiềm được đo hàng tuần. Kết quả đo được là căn cứ để chúng tôi có biện pháp xử lý kịp thời khi chất lượng nước trong hệ thống có dấu hiệu biến đổi theo chiều hướng bất lợi, ảnh hưởng đến cá thí nghiệm.
3.1.1. Nhiệt độ
Theo ghi nhận thí nghiệm 1, nhiệt độ nước của hệ thống thí nghiệm dao động từ 27,5 – 31,4oC, trung bình là 29,3oC ± 0,9 (giá trị trung bình ± SD), được thể hiện qua Hình 3.1 (trang 36). Thí nghiệm 1 được bắt đầu từ tháng 3, thời điểm đó nhiệt
độ không khí thường thay đổi theo chiều hướng thấp hơn khoảng nhiệt thích hợp cho cá. Để đảm bảo nhiệt độ nước trong khoảng tối ưu cho sự sống của cá, chúng
tôi đã lắp hai ống sưởi (công suất 500W/ống). Tuy nhiên, từ tháng 4 đến lúc kết thúc thí nghiệm 1, nhiệt độ không khí ít có sự biến động nên không lắp đặt ống sưởi. Kết quả là nhiệt độ nước dao động trong khoảng thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của cá thí nghiệm, chỉ có hai ngày nhiệt độ xuống dưới 28oC.
Hình 3.1. Sự biến động nhiệt độ trong thời gian tiến hành thí nghiệm 1
3.1.2. Hàm lượng oxy hòa tan (DO)
Hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 5 mg/L là tốt nhất cho sự phát triển của cá