a. Dụng cụ và hóa chất phân tích
Vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus 0,75 mg/ml (Sigma) Lysozyme lòng trắng trứng 10 mg/ml (Sigma)
Dung dịch đệm sodium phosphate (PBS) 0,1M (pH = 6,4) Máy ly tâm, microplate reader
Hình 2.7. Máy microplate reader
b. Bước 1: Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn theo Bảng 2.2 (trang 26).
Pha loãng dung dịch lysozyme gốc (nồng độ 1 mg/ml) bằng 9 eppendorf với 2 eppendorf liên tiếp nhau có nồng độ lysozyme lệch nhau 2 lần.
Cho 20 µl dung dịch lysozyme chuẩn vào 200 µl dung dịch vi khuẩn
M. lysodeikticus, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ Bio – Rad. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Giá trị delta OD (∆OD) được tính theo công thức sau:
∆OD = OD0 - OD15 và x = ∆OD/OD0
Dựa vào nồng độ lysozyme lòng trắng trứng của dung dịch chuẩn và giá trị x
để vẽđồ thịđường chuẩn có phương trình y = ax + b (với điều kiện R2≥ 0,97).
Bảng 2.2. Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn Ký hiệu Dung dịch lysozyme (µl) PBS (µl) Nồng độ (mg/ml) S0 100 900 1 S1 500 (S0) 500 1/21 S2 500 (S1) 500 1/22 S3 500 (S2) 500 1/23 S4 500 (S3) 500 1/24 S5 500 (S4) 500 1/25 S6 500 (S5) 500 1/26 S7 500 (S6) 500 1/27 S8 500 (S7) 500 1/28 S9 500 (S8) 500 1/29
c. Bước 2: Đo hoạt tính lysozyme trong mẫu huyết thanh
Cho 20 µl huyết thanh vào 200 µl dung dịch vi khuẩn M. lysodeikticus, đo
độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ. Ủ hỗn hợp ở
nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh được tính dựa trên phương trình đã được xây dựng ở