2.3.1. Cá thí nghiệm
Cá rô phi vằn (O. niloticus) được sử dụng trong nghiên cứu này có trọng lượng trung bình là 6,15g ± 0,10, có nguồn gốc từ trại cá giống Phú Hữu, quận 9, TP.HCM. Cá được nuôi trong các bể composite 0,5 m³ bằng thức ăn công nghiệp trong 2 tuần để kiểm soát bệnh. Sau đó, tuyển chọn những cá khỏe, không dị hình,
Hình 2.1. Hình dạng ngoài của cá lúc bố trí thí nghiệm
2.3.2. Nguồn nước và hệ thống bể thí nghiệm
Nước sử dụng trong thí nghiệm là nước máy, được trữ trong bể chứa có sục khí ít nhất 24 giờ trước khi cấp vào hệ thống tuần hoàn khép kín. Hệ thống tuần hoàn khép kín được sử dụng để thực hiện thí nghiệm gồm 30 bể (80L/bể). Nước vào các bể thí nghiệm sau khi được lọc tại bể lọc sinh học và nước từ hệ thống các bể sẽ
quay lại và được lọc tại bể lọc sinh học. Nước mất do siphon và bay hơi được bổ
sung từ nguồn nước trữ trong bể chứa.
2.3.3. Thức ăn thí nghiệm
Sáu nghiệm thức thức ăn thí nghiệm được phối trộn có hàm lượng protein (32%) và chất béo (6%) như nhau. Thành phần của các thức ăn thí nghiệm được trình bảy tại Bảng 2.1 (trang 20). Nghiệm thức thức ăn 1 không bổ sung nấm men
được coi là nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức thức ăn 2, 3, 4 và 5 lần lượt được bổ sung 0,03%; 0,125%; 0,5% và 2,0% K. marxianus. Nghiệm thức thức ăn 6 được bổ sung 2,0% S. cerevisiae. Nghiệm thức 6 để xem xét ảnh hưởng của K. marxianus
sovới S. cerevisiae – loài nấm men đã được nghiên cứu nhiều trên cá rô phi vằn. Nguyên liệu làm thức ăn được nghiền mịn, cân và sau đó được trộn bằng máy Hobart (Hobart Inc., Troy, Ohio, USA) trong 15 phút, sau đó cho dầu cá và dầu đậu nành vào và trộn trong 15 phút, tiếp theo cho nước ấm (50oC) vào từ từ
có đường kính 2 mm bằng máy đùn (Hobart Inc., Troy, Ohio, USA). Thức ăn được làm khô bằng máy sấy trong 24 giờ ở 60°C và được trữ ở - 4°C đến khi cho ăn. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn thí nghiệm được phân tích tại Trung tâm phân tích Lareal (Bình Dương).
Hình 2.2. Hình ảnh máy trộn (a), máy ép (b) và máy sấy thức ăn thí nghiệm (c)
2.3.4. Vi khuẩn
Vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm là Aeromonas hydrophila của Khoa Thủy sản, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM và được lưu giữ - 20°C tại Trung Tâm Nghiên Cứu Thủy Sản Công ty Novus. Vi khuẩn A. hydrophilađược sử dụng để gây nhiễm cá rô phi vằn sau khi kết thúc thí nghiệm 1.
a b
Bảng 2.1. Thành phần của 6 khẩu phần thức ăn thí nghiệm trên cá rô phi
Thành phần (g/100g)
Nghiệm thức
YE0,0 YE0,03 YE0,125 YE0,5 YE2,0 BY2,0
Bột đậu nành1 46,70 46,70 46,70 46,70 46,70 46,70 Bột khoai mì lát1 13,70 13,68 13,62 13,33 12,53 13,02 Bột gạo1 12,20 12,20 12,20 12,20 12,20 12,20 Bột bã cải1 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 Bột mì1 5,90 5,90 5,90 5,90 5,90 5,90 Bột cá1 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 Protein đậu nành đậm đặc1 2,73 2,73 2,70 2,63 2,00 1,40 Dầu cá1 2,54 2,54 2,54 2,54 2,54 2,54 Dầu đậu nành1 2,53 2,52 2,52 2,50 2,43 2,54 Dicalcium phosphate1 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 Premix khoáng2 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Premix vitamin3 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 K. marxianus 4 0,00 0,03 0,125 0,50 2,00 0,00 S. cerevisiae 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 MHA (Mera Met)6 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Stay C (25%)7 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 Choline chloride7 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 Tổng (g) 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
1Công ty TNHH Quang Duy, Bình Dương
2 Thành phần (g/kg premix) gồm: cobalt chloride 0,074; cupric sulfate pentahydrate 2,5; ferrous sulfate heptahydrate 73,158; magnesium sulfate heptahydrate 283,98; manganous sulfate monohydrate 6,5; potassium iodine 0,68; sodium selenite 0,1; zinc sulfate heptahydrate 131,92; cellulose 501,088
3 Thành phần (g/ kg premix) gồm: Vitamin B1 0,438; Vitamin B2 0,632; Vitamin B6 0,908; axit D-pantothenic, hemicalcium salt 1,724; niacin 4,583; biotin 0,211; axít folic 0,549; vitamin B12 0,001; inositol 21,053; vitamin K 0,889; vitamin A acetate 0,677; vitamin D3 0,116; DL-alphatocopherol- acetate 12,632; cellulose 955,587
4 Công ty Novus
6 Công ty Novus International, Mỹ 7 Công ty Sigma – Aldrich
Hình 2.3. Thức ăn thí nghiệm
2.3.5. Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus với tỷ lệ khác nhau đến tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sử dụng
thức ăn cá rô phi vằn giống 2.3.5.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm sáu nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần (Hình 2.4). Thí nghiệm được tiến hành trong 10 tuần.
Trước khi bố trí cá vào hệ thống, thả cá vào hai bể (20 cá/bể) trong 24 giờ
nhằm kiểm tra chất lượng nước. Sau 24 giờ, quan sát cá hoạt động bình thường thì bố trí cá vào hệ thống. Cá được bố trí ngẫu nhiên vào 30 bể trong hệ thống tuần hoàn với 20 cá/bể, thể tích bể 120 lít (khoảng 80 lít nước). Tốc độ tăng trưởng của cá thí nghiệm được kiểm tra sau mỗi hai tuần nuôi. Ngừng cho cá ăn 24 giờ trước khi cân.
Hình 2.4. Hệ thống bể thí nghiệm 1
Khi thí nghiệm bắt đầu, lấy ngẫu nhiên 50 cá trữ ở -80°C để phân tích thành phần cơ thể. Cuối thí nghiệm, thu ngẫu nhiên 8 cá/bể, trong đó 5 cá được lưu giữở
- 80°C để phân tích thành phần cơ thể và 3 cá để lấy máu phân tích lysozyme, lấy gan để phân tích superoxide dismutase (SOD). Như vậy, mỗi bể thí nghiệm phân tích 3 mẫu lysozyme, 3 mẫu SOD. Số cá còn lại được sử dụng cho thí nghiệm 2.
2.3.5.2. Quản lý và chăm sóc
Oxy hòa tan, nhiệt độ và pH được đo hàng ngày bằng máy DO 3210 (WTW, Mỹ), pH 3210 (WTW, Mỹ); NH3, NO2-, độ kiềm được đo bằng máy quang phổ
Spectro Flex 6600 (WTW, Mỹ) một lần trong tuần. Cá được cho ăn ngày 2 lần vào lúc 8 – 9 giờ và 16 - 17 giờ. Siphon vào lúc 13 giờ. Tốc độ dòng chảy điều chỉnh ở
mức 1lít/phút. Trọng lượng và số cá chết trong quá trình thí nghiệm được ghi lại hàng ngày. Hình 2.6. Sơđồ bố trí thí nghiệm 1 2.3.5.3. Các công thức tính Tỉ lệ sống: X (%) = 100 x (Nf/Ni) Tăng trọng: WG (%) = 100 x [(W2 – W1)/W1] Tốc độ tăng trưởng đặc biệt: SGR (%/ngày) = 100 x [ln (W2) – ln (W1)] /N Hệ số biến đổi thức ăn: FCR = Lượng thức ăn sử dụng (100% vật chất khô)/W Hiệu quả sử dụng protein:
PER = W/Lượng protein trong thức ăn đã sử dụng (100% vật chất khô) Tỷ lệ tích lũy protein: PR (%) = 100 x [(Wf x Pf) - (Wi x Pi)]/(lượng thức ăn sử dụng x Pe) (100% vật chất khô) Trong đó: Ni : số cá bố trí thí nghiệm
Nf : số cá thu hoạch khi kết thúc thí nghiệm W1 : tổng trọng lượng cá bố trí thí nghiệm (g) W2: tổng trọng lượng cá khi kết thúc thí nghiệm (g)
W3: tổng trọng lượng cá chết trong quá trình thí nghiệm (g) W: tăng trọng của cá thí nghiệm (g)
W (g) = W2 – W1 + W3 N: Số ngày thí nghiệm
Wf: tổng trọng lượng (tính theo vật chất khô) cá khi kết thúc thí nghiệm Wi: tổng trọng lượng (tính theo vật chất khô) cá bố trí thí nghiệm Pf: % protein (100% vật chất khô) của cá kết thúc thí nghiệm Pi: % protein (100% vật chất khô) của cá bố trí thí nghiệm Pe : % protein (100% vật chất khô) của thức ăn thí nghiệm
2.3.5.4. Phương pháp phân tích thành phần cơ thể cá
Hàm lượng protein được phân tích theo phương pháp chuẩn (AOAC., 2000). Các chỉ tiêu khác như chất béo, độ ẩm và tro cũng được phân tích theo AOAC (2000).
Chuẩn bị mẫu cá để phân tích thành phần cơ thể: Lấy cá được lưu giữ - 80°C (cá kết thúc thí nghiệm và cá trước khi thí nghiệm) nghiền mịn bằng máy ST – 04A (Trung Quốc) trong 6 phút. Mẫu cá đã nghiền được đóng túi với lượng 100g/bể
và được giữở - 80°C đến khi gửi đi phân tích. Các mẫu cá được gửi phân tích tại Trung tâm phân tích Lareal.
2.3.5.5. Phương pháp lấy máu cá để thu huyết thanh
Ngừng cho cá ăn 24 giờ trước khi lấy máu. Thu máu bằng kim tiêm G23 ở động mạch đuôi. Huyết thanh thu được sau khi ly tâm (5000 vòng/phút, 10 phút ở
4oC) được bảo quản ở - 80°C để phân tích hoạt độ lysozyme.
2.3.5.6. Phương pháp phân tích lysozyme a. Dụng cụ và hóa chất phân tích a. Dụng cụ và hóa chất phân tích
Vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus 0,75 mg/ml (Sigma) Lysozyme lòng trắng trứng 10 mg/ml (Sigma)
Dung dịch đệm sodium phosphate (PBS) 0,1M (pH = 6,4) Máy ly tâm, microplate reader
Hình 2.7. Máy microplate reader
b. Bước 1: Xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn theo Bảng 2.2 (trang 26).
Pha loãng dung dịch lysozyme gốc (nồng độ 1 mg/ml) bằng 9 eppendorf với 2 eppendorf liên tiếp nhau có nồng độ lysozyme lệch nhau 2 lần.
Cho 20 µl dung dịch lysozyme chuẩn vào 200 µl dung dịch vi khuẩn
M. lysodeikticus, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ Bio – Rad. Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Giá trị delta OD (∆OD) được tính theo công thức sau:
∆OD = OD0 - OD15 và x = ∆OD/OD0
Dựa vào nồng độ lysozyme lòng trắng trứng của dung dịch chuẩn và giá trị x
để vẽđồ thịđường chuẩn có phương trình y = ax + b (với điều kiện R2≥ 0,97).
Bảng 2.2. Chuẩn bị dung dịch lysozyme chuẩn Ký hiệu Dung dịch lysozyme (µl) PBS (µl) Nồng độ (mg/ml) S0 100 900 1 S1 500 (S0) 500 1/21 S2 500 (S1) 500 1/22 S3 500 (S2) 500 1/23 S4 500 (S3) 500 1/24 S5 500 (S4) 500 1/25 S6 500 (S5) 500 1/26 S7 500 (S6) 500 1/27 S8 500 (S7) 500 1/28 S9 500 (S8) 500 1/29
c. Bước 2: Đo hoạt tính lysozyme trong mẫu huyết thanh
Cho 20 µl huyết thanh vào 200 µl dung dịch vi khuẩn M. lysodeikticus, đo
độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (OD0) bằng máy quang phổ. Ủ hỗn hợp ở
nhiệt độ phòng (25oC) và đo độ hấp thụ ánh sáng sau 15 phút (OD15). Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh được tính dựa trên phương trình đã được xây dựng ở
2.3.5.7. Phương pháp phân tích SOD a. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ và hóa chất
Sodium phosphate buffer (pH = 7,4)
A: Hòa 331,495 g Na2HPO4.7H2O với 1.250 ml nước cất B: Hòa 7,0098 g NaH2PO4.2H2O với 500 ml nước cất
Trộn 1.150 ml dung dịch A với 190 ml dung dịch B được dung dịch C, điều chỉnh pH = 7,4 bằng cách thêm hoặc bớt dung dịch A và B.
Bradford reagent
Hòa 100 mg coomassive G – 250 với 50 ml methanol, 100 ml H3PO4 và cho thêm nước cất đểđược 1.000 ml dung dịch.
Bovine serum albumin (BSA) 96%
Hòa 1,5 g BSA trong 100 ml PBS được protein chuẩn với nồng độ 14.400
µg/ml.
Assay buffer (10 X): Hoà 3 ml assay buffer với 27 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 2 tháng. Assay buffer có các thành phần 50 mM Tris – HCl, pH 8,0; 0,1 mM axít diethylene triamine pentaacetic (DTPA) và 0,1 mM hypoxanthine.
Sample buffer (10 X): Hòa 2 ml sample buffer (50 mM Tris – HCl, pH 8,0) với 18 ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở 4°C, thời gian bảo quản 6 tháng.
Radical detector: Hòa 50 µl radical detector với 19,95 ml assay buffer. Thời gian bảo quản là 2 giờ.
SOD chuẩn (Cayman, Mỹ): Bảo quản trong đá, lọ 100 µl thuộc bộ kit
Xanthine oxidase: Hòa 50 µl với 1,95 ml sample buffer. Dung dịch được giữ trong đá, thời gian bảo quản là 1 giờ.
b. Chuẩn bị mẫu
Nghiền 0,5g gan trong 3ml dung dịch đệm (PBS) đã chuẩn bị ở phần trên (pH = 7,4) trong 30 giây (trong đá).
Ly tâm mẫu gan với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C Lấy phần dịch trong phía trên ra eppendorf mới
Pha loãng mẫu 200 lần bằng PBS, mẫu này dùng để phân tích hàm lượng protein và SOD.
c. Các bước phân tích
Bước 1: Phân tích hàm lượng protein trong mẫu Xây dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn theo Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn
Ký hiệu Nồng độ (µg/ml) BSA (µl) PBS (µl) S0 100 900 1440 S1 500 (S0) 500 720 S2 500 (S1) 500 360 S3 500 ( S2) 500 180 S4 500 (S3) 500 90 S5 500 (S4) 500 45 S6 500 (S5) 500 22,5 S7 500 (S6) 500 11,25 S8 500 (S7) 500 5,625 S9 500 (S8) 500 2,8125 S10 500 (S9) 500 1,40625 S11 500 (S10) 500 0,703125 S12 500 (S11) 500 0,3515625 S13 500 (S12) 500 0,17578125 S14 500 (S13) 500 0,087890625 B (blank) - 1000 0
Đo hàm lượng protein của dung dịch protein chuẩn
Hút 150 µl Bradford /giếng rồi cho 50 µl dung dịch B (blank), S14 đến S1
(Bảng 2.3) vào các giếng tương ứng, ngay sau đó đo quang phổ ở bước sóng 595 nm. Từ số liệu OD thu được, xây dựng phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b (R2
≥ 0,98) (trong đó y là giá trị OD, x là hàm lượng protein (µg/ml)).
Đo hàm lượng protein trong mẫu
Hàm lượng protein trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hàm lượng protein trong dung dịch protein chuẩn, chỉ thay 50 µl của S1 đến S14 bằng mẫu.
Hàm lượng protein trong mẫu được xác định theo công thức 2.1
A = Hàm lượng − = a b y (µg/ml)
protein x độ pha loãng (2.1) Trong đó, y là các giá trị OD của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ số
tự do của phương trình đường chuẩn protein.
Bước 2: Đo hàm lượng SOD
Xây dựng đường chuẩn SOD
Chuẩn bị dung dịch superoxide dismutase (SOD) chuẩn: hòa 20 µl SOD chuẩn (Cayma) với 1,98 ml sample buffer để được SOD gốc. Pha dung dịch SOD chuẩn theo Bảng 2.4 (trang 29).
Đo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn
Hút 200 µl dung dịch radical detector rồi hút 10 µl dung dịch SOD chuẩn từ
S0 đến S6 cho một giếng (A - G) (Hình 2.8); sau đó cho tiếp 20 µl dung dịch xanthine oxidase vào mỗi giếng; sau khi ủ 45 phút ở nhiệt độ phòng đem đo ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate reader.
Phương trình tuyến tính chuẩn SOD được xác định dựa vào đường tuyến tính chuẩn. Đường tuyến tính chuẩn được xác định dựa vào các tỷ lệ tuyến tính
(linearized rate - LR). Tỷ lệ tuyến tính được tính từ các giá trị hấp thụ quang phổ
theo công thức:
LRo = Aso/ Aso; LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR6 = Aso/ As6
Trong đó: LRo là tỷ lệ tuyến tính của S0; Aso - As6 là giá trị OD của S0đến S6 tương ứng
Phương trình tuyến tính có dạng: y = ax + b (R2 ≥ 0,99) (trong đó x là hoạt
độ SOD (U/ml); y là LR) Bảng 2.4. Bảng SOD chuẩn Eppendorf SOD gốc (µl) Mẫu đệm (sample buffer) (µl) Hoạt độ của SOD (U/ml) S0 0 1.000 0 S1 20 980 0,025 S2 40 960 0,050 S3 80 920 0,100 S4 120 880 0,150 S5 160 840 0,200 S6 200 800 0,250 Đo hoạt độ SOD trong mẫu
Hoạt độ SOD trong các mẫu được xác định tương tự nhưđo hoạt độ SOD trong dung dịch SOD chuẩn, chỉ thay 10 µl của S0 đến S6 bằng mẫu.
Công thức tính
Hoạt độ của SOD của mẫu được tính dựa vào phương trình tuyến tính chuẩn.
Hoạt độ SOD được tính bởi công thức 2.2
B = Hoạt độ − = a b y (U/ml)
Trong đó, y là các giá trị LR của các mẫu; a, b lần lượt là hệ số góc và hệ
số tự do của phương trình đường chuẩn SOD
LR của các mẫu gan được tính theo công thức:
LR1 = Aso/ As1; LR2 = Aso/ As2; LR3 = Aso/ As3;... LR30 = Aso/ As30 Aso là giá trị OD của S0ở Bảng 2.4
As1 – As30 là giá trị OD của mẫu gan từ 1 đến 30, tương ứng Hoạt độ SOD theo hàm lượng protein được tính bởi công thức 2.3
SOD (U/µg protein) = B/A (2.3)
(Trong đó A, B lần lượt là hàm lượng protein và SOD trong mẫu)
A – G: mẫu chuẩn; S1 – S41: giếng mẫu
2.3.6. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của các khẩu phần có bổ sung
K. marxianus đến khả năng kháng bệnh với vi khuẩn A. hydrophila của cá rô
phi vằn giống
2.3.6.1. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.9. Hệ thống bể thí nghiệm 2
Kết thúc thí nghiệm 1, cá thuộc cùng một nghiệm thức thí nghiệm được phân bố ngẫu nhiên vào 3 bể (40 L/bể) với mật độ 10 cá/bể. Cá được chăm sóc và theo dõi tương tự thí nghiệm 1 trong 6 ngày trước khi cảm nhiễm với vi khuẩn
A. hydrophila.
Cá được gây bệnh bằng phương pháp ống thông dạ dày với mật độ vi khuẩn là 1010 CFU/ml hỗn hợp thức ăn và vi khuẩn.
2.3.6.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
Quy trình nuôi cấy vi khuẩn
- Lấy dung dịch vi khuẩn gốc cấy trên môi trường TSA, sau đó ủđĩa 12 giờở