2.6.1. Chất bổ trợ của vacxin
Chất bổ trợ vacxin (Adjuvant) là một tác nhân dược lý hoặc miễn dịch làm thay đổi hiệu quả của các tác nhân khác. Bổ trợ vacxin có thể được thêm vào vacxin để thay đổi đáp ứng miễn dịch bằng cách thúc đẩy để tạo được lượng kháng thể cao hơn và kéo dài thời gian bảo vệ, nhờ đó giảm thiểu lượng chất ngoại sinh truyền vào cơ thể. Bổ trợ vacxin còn có thể dùng để nâng cao hiệu quả vacxin bằng cách thay đổi đáp ứng miễn dịch đối với từng loại tế bào miễn dịch cụ thể: ví dụ, hoạt hóa tế bào T thay vì tế bào B tiết kháng thể tùy thuộc vào mục đích của vacxin. Bổ trợ vacxin còn được dùng trong quá trình sản xuất kháng thể từ những động vật được gây miễn dịch. Có nhiều lớp bổ trợ vacxin có thể thúc đẩy
đáp ứng miễn dịch theo nhiều hướng khác nhau, nhưng dạng được sử dụng phổ biến nhất là nhôm hydroxit và dầu sáp.
Bổ trợ được thêm vào vacxin để kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng với kháng nguyên mục tiêu, nhưng tự chúng không tạo miễn dịch. Bổ trợ vacxin có thể hoạt động theo nhiều cách khác nhau trong việc trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch. Bổ trợ vacxin có thể hoạt động như một chất mang kháng nguyên, phóng thích kháng nguyên trong một thời gian dài, nhờ đó tối đa hóa đáp ứng miễn dịch đến khi cơ thể loại bỏ hoàn toàn kháng nguyên. Ví dụ một loại chất mang bổ trợ vacxin là nhũ tương. Bổ trợ vacxin còn có thể hoạt động như một chất kích thích, tham gia và khuếch đại phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Cơ chế của bổ trợ vacxin: Bổ trợ vacxin cần thiết trong việc cải thiện về định hướng và thích ứng của đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên. Phản ứng này được trung gian bởi hai loại tế bào lympho chính, tế bào B và T. Bổ trợ vacxin thực hiện hiệu quả của chúng qua nhiều cơ chế khác nhau. Một vài loại bổ trợ vacxin, ví dụ như phèn, hoạt động như một hệ thống vận chuyển, tạo thành chất mang bắt giữ kháng nguyên ở vi trí tiêm, cung cấp sự phóng thích chậm và kéo dài để kích thích phản ứng miễn dịch. Giả thuyết này hiện còn gây tranh cãi, nhiều nghiên cứu cho thấy việc phẫu thuật loại bỏ các chất mang trên không làm ảnh hưởng đến cường độ của phản ứng IgG1.
Bổ trợ vacxin như một tác nhân tạo ổn định: Mặc dù các bổ trợ vacxin miễn dịch được nhìn nhận như các chất hỗ trợ cho phản ứng miễn dịch với kháng nguyên, các bổ trợ vacxin còn được phát triển như các chất hỗ trợ ổn đinh cấu trúc của kháng nguyên, nhất là các vacxin đã được chấp nhận trong ngành thú y.
Các loại bổ trợ vacxin bao gồm: Hợp chất vô cơ: phèn, nhôm hydroxit, nhôm phosphate, calci phosphate hydroxide; Dầu khoáng: dầu sáp; Các sản phẩm từ vi khuẩn: vi khuẩn Bordetella pertussis, Mycobacterium bovis chết, các biến độc tố; Các chất hữu cơ không nguồn gốc vi khuẩn: squalene; Hệ thống vận chuyển: các chất tẩy rửa (Quil A); Các saponin thực vật từ Quillaja, đậu tương, Polygala senega; Cytokin: IL-1, IL-2, IL-12; Hỗn hợp: bổ trợ vacxin Freund hoàn toàn, bổ trợ vacxin Freund không hoàn toàn; Thực phẩm từ dầu: Bổ trợ vacxin.
Cơ chế kích thích miễn dịch bởi bổ trợ vacxin: Bổ trợ vacxin có thể tăng cường đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên bằng những cách khác nhau: kéo dài sự hiện diện của kháng nguyên trong máu; giúp hấp thụ kháng nguyên trình diện
32
tế bào kháng nguyên; hoạt hóa đại thực bào và tế bào lympho; hỗ trợ sản xuất cytokine
Chất bổ trợ có thể hoạt động bằng sự kết hợp của nhiều cơ chế khác nhau bao gồm hình thành nơi lưu giữ kháng nguyên, cảm ứng cytokine và chemokine, kích thích các tế bào miễn dịch, tăng cường sự hấp thu và trình bày kháng nguyên, thúc đẩy vận chuyển kháng nguyên đến các hạch bạch huyết. Dường như chất bổ trợ kích hoạt các phản ứng miễn dịch bẩm sinh để tạo ra một môi trường có thẩm quyền miễn dịch tại chỗ vị trí tiêm. Tùy thuộc vào loại phản ứng bẩm sinh được kích hoạt, chất bổ trợ có thể thay đổi chất lượng và số lượng của các phản ứng miễn dịch thích ứng. Hiểu các cơ chế hoạt động của chất bổ trợ sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cách ảnh hưởng của miễn dịch bẩm sinh sự phát triển của miễn dịch thích ứng, giúp xây dựng hợp lý các vacxin chống lại các bệnh.
Mục tiêu của tiêm chủng là tạo miễn dịch bảo vệ và trong một số loại vacxin, điều này có thể được tăng cường bằng cách bổ sung các chất bổ trợ. Chất bổ trợ (từ tiếng Latinh adjuvare, có nghĩa là "giúp đỡ hoặc hỗ trợ") lần đầu tiên được Ramon mô tả là “các chất được sử dụng kết hợp với một kháng nguyên cụ thể để tạo ra một đáp ứng miễn dịch hơn kháng nguyên đơn thuần” (Ramon, 1924). Nhiều các loại hợp chất đa dạng đã được đánh giá như là chất bổ trợ bao gồm muối khoáng, sản phẩm vi sinh vật, nhũ tương, saponin, cytokine, polyme, vi hạt và liposome (Guy, 2007).
Dựa trên cơ chế hoạt động, chất bổ trợ vacxin đã được chia rộng rãi thành hệ thống phân phối và chất bổ trợ kích thích miễn dịch (Singh và O’Hagan, 2003). Nói chung, hệ thống phân phối trước đây được cho là hoạt động bằng cách cung cấp kho trong khi các chất bổ trợ kích thích miễn dịch kích hoạt các tế bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh (Pashine & cs, 2005). Tuy nhiên, cách phân loại này không còn phù hợp vì hiện nay có bằng chứng cho thấy một số hệ thống phân phối có thể kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh. Những tiến bộ gần đây trong sinh học miễn dịch nghiên cứu đã tiết lộ một số cơ chế hoạt động của chất bổ trợ. Bằng chứng hiện có cho thấy rằng chất bổ trợ sử dụng một hoặc nhiều các cơ chế sau để tạo ra các phản ứng miễn dịch: (1) giải phóng kháng nguyên bền vững tại vị trí tiêm (hiệu ứng kho), (2) điều hòa các cytokine và chemokine, (3) tuyển dụng tế bào tại vị trí tiêm, (4) tăng hấp thu kháng nguyên và trình bày với các tế bào trình bày kháng nguyên (APC), (5) kích hoạt và sự trưởng thành của APC [tăng phức hợp tương hợp mô chính (MHC) lớp II và biểu hiện phân tử đồng kích thích] và di
chuyển đến các hạch bạch huyết, và (6) kích hoạt viêm nhiễm (Cox & Coulter, 1997; Hoebe & cs., 2004; Fraser & cs., 2007).
Trong nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phẫu thuật cắt bỏ kho kháng nguyên 14 ngày sau khi chủng ngừa không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch (Schijns, 2000). Rõ ràng, sự hấp phụ của kháng nguyên đối với phèn không cần thiết cho hoạt tính của chất bổ trợ phèn (Iyer & cs., 2003; De Gregorio & cs., 2008). Loại bỏ vết tiêm 2 giờ sau khi kháng nguyên và sử dụng phèn chua không ảnh hưởng đến dịch thể hoặc qua trung gian tế bào miễn dịch (Hutchison & cs, 2012). Nhiều chất bổ trợ bao gồm phèn, nhũ tương gốc dầu và các vi hạt hoạt động bằng cách "nhắm mục tiêu" các kháng nguyên đến APC, dẫn đến tăng cường trình bày kháng nguyên của MHC (Guéry & cs., 1996; Schijns & Lavelle, 2011).
2.6.2. Muối khoáng
Nhôm hydroxit hay hỗn hợp muối nhôm (thường gọi là keo phèn), là một trong những chất bổ trợ đầu tiên được sử dụng trong vacxin. Nhôm saltcan tạo ra IgG bậc cao với khả năng miễn dịch tương đối lâu dài, dễ bào chế và được ghi nhận lâu dài về độ an toàn của gen. Các thí nghiệm ban đầu với phèn kali (KAl
(SO4) 2: 12H2O) được sử dụng với độc tố đã chứng minh rằng phản ứng miễn dịch
tăng cường ở thỏ chống lại độc tố (Glenny & cs., 1931).
Vacxin được cho thêm chất bổ trợ với mục đích giữ lâu kháng nguyên trong cơ thể động vật, tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch. Chất bổ trợ thường dùng là keo phèn và vacxin có keo phèn gọi là vacxin keo phèn.
2.6.3. Chất nhũ tương
Cũng như muối khoáng, nhũ tương đã được sử dụng như một loại chất bổ trợ trong vacxin động vật trong một thời gian dài. Nhũ tương được hình thành khi hai chất lỏng không thể trộn lẫn được với nhau, một trong số chúng có thể sắp xếp thành các giọt nhỏ, tách biệt bên trong hạt kia và được ổn định bởi một lớp siêu thực giao diện. Nhũ tương cũng là một lựa chọn tốt cho các loại vacxin dành cho động vật vì chúng dễ sản xuất, hiệu quả về chi phí và chứng tỏ hiệu quả tốt trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch (Cox & Coulter, 1997).
Công ty Seppic (Pháp) là công ty cung cấp các chất bổ trợ cho vacxin. Các chất bổ trợ gồm có: - Montanide ISA là chất bổ trợ dầu cho vacxin. Tăng cường và tập trung phản ứng miễn dịch.
- Montanide IMS: Chất bổ trợ nước tích hợp vi nhũ tương - Montanide GEL: Các chất bổ trợ sử dụng polyme.
34
Chất bổ trợ Montanide đã được Ủy ban thú y đánh giá là an toàn cho các ứng dụng thú y:
- Nhôm hydroxit
- Nhũ tương dầu (O / W và W / O / W) gồm: ISA 206 VG (50%); ISA 201 VG (50%); ISA 15A VG (15%) ISA 35 VG (25%); Dầu không khoáng (w / w)
- Vi nhũ tương (nano) gồm IMS 1313 VG (25-50%); IMS 1313 VG N (25- 50%);
- Chất bổ trợ polyme: GEL 01 (10-20%); GEL 02 (10-15%)
MONTANIDETM IMS là một loạt các chất bổ trợ sẵn sàng để pha loãng, có chứa sự kết hợp của vi nhũ tương và hợp chất kích thích miễn dịch được liệt kê là các chất GRAS (được công nhận là an toàn). Chất bổ trợ này, không có thành phần nguồn gốc động vật, có sẵn ở dạng vô trùng (ST) hoặc cấp bảo quản (PR, 0,01% thimerosal). MONTANIDETM IMS 1313 VG N dễ tạo công thức bằng cách pha loãng đơn giản với môi trường nước và tạo thành chất lỏng và vacxin dễ tiêm. Nó tương thích với các dung dịch đệm phốt phát (PBS). Chuẩn bị vacxin: Để chuẩn bị 100 g vacxin: - MONTANIDETM IMS 1313 VG N: 50 g - Môi trường nước kháng nguyên: 50 g Chế phẩm ổn định thu được bằng cách pha loãng tá dược MONTANIDETM IMS 1313 VG N vào môi trường nước, ở nhiệt độ phòng hoặc thấp hơn, dưới kích động vừa phải (ví dụ chân vịt biển, máy khuấy từ).
Chất bổ trợ MONTANIDE IMS 1313 VG N được khuyến cáo cho các vacxin tiêm và niêm mạc lợn. Chất bổ trợ MONTANIDE IMS 1313 VG N cũng được khuyên dùng cho vacxin niêm mạc gia cầm, gia súc và gia súc nhai lại nhỏ. Ưu điểm: MONTANIDETM IMS 1313 VG N cho phép sản xuất dễ dàng, ngay cả với môi trường PBS, vacxin dung nạp tốt với độ an toàn ngắn hạn tốt (không có phản ứng chung) và khả năng chịu đựng tại chỗ tuyệt vời (không có phản ứng tại chỗ tiêm sau khi giết mổ). Chất bổ trợ này có thể tạo ra các phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và nhanh chóng với tính bền vững, đặc biệt trong trường hợp tiêm chủng hai mũi. An toàn và quy định: Các thử nghiệm độc tính được thực hiện trên phạm vi MONTANIDETM (thử nghiệm Berlin, LD 50 qua đường miệng, IP LD 50, thử nghiệm kích ứng mắt, thử nghiệm kích ứng da, khả năng gây sốt) kết luận về tính không độc và khả năng dung nạp thuận lợi của các chất bổ trợ này. Nó đã được chứng minh rằng nó là một chất bổ trợ tuyệt vời để kích thích phản ứng dịch thể. Sản phẩm này được khuyên dùng cho các loại kháng nguyên khác
nhau: vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và cho vacxin sống bất hoạt, tiểu đơn vị hoặc biến đổi.
2.6.4. Cytokine
Cytokine là những chất đóng vai trò quan trọng trong các đáp ứng qua trung gian tế bào. Việc sử dụng các cytokine làm chất bổ trợ cho vacxin dành cho động vật đã được nghiên cứu (Lin R & cs., 1995). Ví dụ, IL-2, IL-12 và IFN-cf kích hoạt sự kích thích của các tế bào Th1 chịu trách nhiệm cho các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào chống lại các mầm bệnh nội bào.
2.6.5. Saponin
Saponin là các hợp chất lưỡng tính bao gồm một hoặc nhiều phần tử glycoside ưa nước gắn với dẫn xuất triterpene lipo-philic. Hiện nay những chất có nguồn gốc tự nhiên này được sử dụng trong nhiều ứng dụng dược phẩm. Khả năng kích thích các phản ứng miễn dịch nên saponin đã được dùng như một chất bổ trợ trong sản xuất vacxin dành cho động vật. Chất bổ trợ thuộc loại saponin nổi bật nhất là Quil-A (Brenntag Biosector A / S, Đan Mạch).
2.6.6. Các chất cao phân tử
Những chất này thường được sử dụng trong bảo quản kháng nguyên trong vacxin và giải phóng có kiểm soát sau khi tiêm (Ferreira & cs., 2013). Ngoài ra, một số chất cũng có khả năng kích thích sản sinh miễn dịch. Theo Lai & cs. (2012), một số chất polyme tổng hợp và tự nhiên có hoạt tính miễn dịch làm chất bổ trợ cho vacxin trong thú y đang được xem xét ứng dụng.
Như vậy nhiều chất tự nhiên và tổng hợp có thể được sử dụng làm chất bổ trợ để cải thiện hiệu lực của vacxin động vật trong khi những chất khác (cytokine và polypho-sphazenes) vẫn được đánh giá bằng thực nghiệm. Một số tiêu chí cần được xem xét trong việc lựa chọn và phát triển chất bổ trợ cho vacxin động vật như sau: hiệu quả đối với các loài sinh vật đích, cảm ứng miễn dịch dự phòng nhanh chóng và lâu dài, an toàn cho động vật, tuân thủ quy định an toàn thực phẩm, tính khả thi để sản xuất quy mô và cuối cùng không kém phần hiệu quả về chi phí.
36
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia.
- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam.
- Phòng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavetvà một số cơ sở chăn nuôi lợn.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài thực hiện từ tháng 6 năm 2016 đến tháng 6 năm 2020.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm phổi ởlợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có:
+ Vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b. + Vi khuẩn P. multocida serotype A và D.
+ Vi khuẩn S. suis serotype 2.
- Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi ở lợn.
+ Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO agar …
+ Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%, ...
+ NAD do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
+ Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 do công ty Seppic- Pháp cung cấp. - Động vật thí nghiệm:
+ Lợn sau cai sữa khỏe mạnh không tiêm vacxin có kháng nguyên
+ Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh. - Máy móc, dụng cụ thí nghiệm
+ Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ ... để thực hiện các kỹ thuậtnhư PCR, RT-PCR; ELISA, ....
+ Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp như bộ máy lên men sục khí 15 lít và 120 lít SATORIUS của Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh
viêm phổi do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây ra
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn P. multocida gây ra
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra
3.4.2. Nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của bộ giống sản
xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis gây ra