P. multocida
3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu
Kiểm tra an toàn Bộ giống gốc
Thạch máu, thạch PPLO, BHI
Giống nhỏ: TYE, TSB, THB
Giống sản xuất: TYE, TSB, THB
Lên men sục khí: TW, TSB, THB
Vô hoạt bằng formol 0,3%
Bổ sung nhũ dầu 25%
Dán nhãn thành phẩm Ra chai bán thành phẩm
Kiểm tra vô trùng Kiểm tra hiệu lực
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra thuần khiết
Đếm số và kiểm tra thuần khiết
Kiểm tra vô trùng
3.5.3.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết, vô trùng
Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685- 2017 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia.
3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Kiểm tra an toàn: vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm.
3.5.3.4. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực
a.Kiểm tra trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế: Thí nghiệm được bố trí thành 3 lô:
- Lô 1: Chia 2 nhóm, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 15 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày và nhóm đối chứng gồm 15 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (LD50 = 4,8 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.
- Lô 2: Chia 2 nhóm, cách tiêm như lô 1, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 10 chuột và nhóm đối chứng 10 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn P. multocida
(LD50 = 4,2 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. - Lô 3: Chia 2 nhóm, cách tiêm như ở lô 1 và 2, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 5 chuột, nhóm đối chứng 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis (LD50 = 4,4 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.
b. Kiểm tra hiệu lực trên lợn bằng phương pháp trọng tài:
Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi, không
nhiễm mầm bệnh tự nhiên (âm tính với kháng thể kháng A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis). Thí nghiệm được tiến hành chia lô và tiêm vacxin cho lợn như sau:
+ Lô thí nghiệm: 21 lợn, đánh số tai từ TN1 đến TN21, tiêm vacxin liều sử dụng 2 ml/con, tiêm bắp.
46
+ Lô đối chứng: 14 lợn, đánh số tai ĐC1 đến ĐC14, tiêm nước thịt vô trùng, liều tiêm và đường tiêm tương tự lô thí nghiệm.
Sau 21 ngày tiêm vacxin và nước thịt vô trùng, công cường độc cho lợn ở lô thí nghiệm và lô đối chứng bằng cách tiêm 7 chủng vi khuẩn cường độc tiêu chuẩn vào dưới da, mỗi chủng vi khuẩn cho 3 lợn ở lô thí nghiệm và 2 lợn ở lô đối chứng, liều 5ml/con, tương đương với liều gây bệnh thực nghiệm là 4,5 x 109 vi khuẩn/ml đối với từng loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.
3.5.3.5. Phương pháp đánh giá kiểm tra kháng thể
Hiệu giá kháng thể chống vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b);
P. multocida (serotype A, serotype D) và S. suis serotype 2 được xác định dựa vào tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-15:2017, tiêu chuẩn ngành TCN 940-2006, tiêu chuẩn cơ sở TCCS 02VT-92/KNI và quy trình tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia. Hiệu giá kháng thể được biểu thị dưới dạng log2 và được xác định vào các thời điểm trước khi tiêm phòng, sau khi tiêm phòng 21 ngày, 2 tháng, 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng.
a. Phương pháp xác định kháng thể A. pleuropneumoniae bằng ELISA
- Tên bộ Kit: ID Screen APP 2,5 Indirect; - Hãng sản xuất: ID.vet Innovative Diagnostics
Hóa chất được cung cấp trong bộ Kit
STT Tên hóa chất
1 Đĩa đã gắn kháng nguyên APP 2/5
2 Conjugate (10X) 3 Đối chứng dương 4 Đối chứng âm 5 Dilution Buffer 2 6 Dilution Buffer 19 7 Đệm rửa (20X) 8 Cơ chất 9 Stop solution (0.5M)
Lưu ý: Conjugate, các ống đối chứng, cơ chất phải được giữ trong đá gel hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác.
Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC.
Trong bộ Kit ELISA có tên là ID Screen APP 2,5 Indirect của Hãng ID, trong mỗi giếng đều gắn 1 số lượng kháng nguyên A.pp nhất định, khi gắn với kháng thể kháng A.pp serotype 2 hoặc 5 có trong huyết thanh lợn sẽ cho các kết quả khác
nhau phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh lợn được tiêm vacxin. Khi các chỉ số OD và S/P cao chứng tỏ vacxin kích thích cơ thể lợn sinh kháng thể tốt hơn.
- Tiến hành:
Để các hóa chất và các mẫu huyết thanh ở nhiệt độ phòng (21oC ± 5oC) trong 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm. Các ống chứa mẫu huyết thanh và các ống đối chứng cần được trộn đều bằng máy vortex và spin nhanh trước khi tiến hành các phản ứng. Pha loãng Wash solution từ 20X xuống 1X.
Bước 1: Nhỏ 100 µl đối chứng âm, 100 µl đối chứng dương vào các giếng đối chứng. Nhỏ 250 µl dilution buffer 2 và 5 µl mỗi mẫu huyết thanh vào các giếng còn lại.
Bước 2: Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC.
Bước 3: Chuẩn bị 1X Conjugate bằng cách pha loãng Conjugate 10X với tỉ lệ 1/10 trong Dilution buffer 19.
Bước 4: Đổ bỏ dịch. Rửa mỗi giếng 3 lần bằng 1X Wash solution (300 µl/ giếng) sử dụng pipet đa kênh.Tránh để giếng khô giữa các lần rửa.Ở lần rửa cuối, đảo ngược giếng rồi vỗ mạnh vào giấy khô.
Bước 5: Bổ sung 100 µl 1X conjugate vào mỗi giếng. Ủ 30 phút ± 3 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC.
Bước 6: Lặp lại bước 4
Bước 7: Bổ sung 100 µl cơ chất vào mỗi giếng. Ủ 15 phút ± 2 phút ở nhiệt độ phòng 21oC ± 5oC trong tối (phủ giấy bạc kín các giếng).
Bước 8: Thêm 100 µl Stop solution vào mỗi giếng.
Đọc kết quả OD ở bước sóng 450 nm. Kết quả có ý nghĩa khi: - Giá trị OD của đối chứng dương lớn hơn 0,35: OD(PC) > 0,350
- Tỉ số giá trị OD của đối chứng âm và đối chứng dương nhỏ hơn 0,3: OD (NC)/OD (PC) < 0,3
- S/P % = [(OD mẫu – OD chứng âm)/ (OD chứng dương – OD chứng âm)] *100
S/P Kết quả
S/P % < 30 % Âm tính
30% ≤ S/P % < 40 % Nghi ngờ
S/P % ≥ 40 % Dương tính
48
hoặc đá bào (5oC ± 3 oC) trong quá trình thao tác. Các hóa chất khác có thể giữ ở 2oC và 26oC.
b. Phương pháp đánh giá hàm lượng kháng thể kháng P. multocida và S. suis bằng phản ứng ngưng kết chậm
- Chuẩn bị kháng nguyên thân (KNO - Somatic antigen- KN xử lý axít HCL 1N): Cấy 0,01 ml vi khuẩn P. multocida hay S.suis vào môi trường thạch máu, ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch rồi cấy vào môi trường nước thịt BHI hay TSB (ống 4 ml), rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24h. Láng 4 ml canh trùng lên 2 đĩa thạch máu, hút bỏ dịch còn thừa đi, rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch máu bằng cách dùng 5ml PBS rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm. Nhỏ 0,02 ml Formaldehyde solution 37% vào huyễn dịch vi khuẩn thu được rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn. Huyễn dịch vi khuẩn đạt chỉ tiêu vô trùng sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml EDTA 1%, lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37°C trong 24 h. Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 min ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS có bổ sung 0,3% Formaldehyde solution, lặp lại 2 lần. Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn bằng máy ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS để thu hoạch kháng nguyên. Kiểm tra kháng nguyên xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết.
- Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra: Lấy máu động vật, chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi cách thủy ở nhiệt độ 56°C trong 30 phút.
- Cách tiến hành: Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U.
+ Đối với các giếng thí nghiệm: cho dung dịch PBS vào các dãy giếng thí nghiệm trên đĩa 96 đáy chữ U (50 μl/giếng). Thêm vào giếng đầu tiên 50 μl huyết thanh và pha loãng huyết thanh theo cơ số 2. Nhỏ vào các giếng 50 μl kháng nguyên.
+ Đối chứng âm: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl kháng nguyên.
+ Đối chứng dương: 50 μl dung dịch PBS + 50 μl huyết thanh tối miễn dịch và pha loãng theo cơ số 2 + 50 μl kháng nguyên
+ Lắc nhẹ cho đều rồi dính băng dính để ở tủ ấm 37°C qua đêm
- Đọc kết quả: Phản ứng âm tính: kháng nguyên lắng tròn đáy giếng. Phản ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng. Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.
c. So sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của vacxin đa giá bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu
Chúng tôi sử dụng 13 lợn không tiêm vacxin có kháng nguyên
A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis để tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis của vacxin đa giá có bổ trợ keo phèn và vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu.
Lợn thí nghiệm được chia ra 3 lô:
Lô 1: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ keo phèn, với ký hiệu TN1 đến TN5.
Lô 2: có 5 lợn, được tiêm vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu, ký hiệu TN6 đến TN10.
Lô 3: có 3 lợn đối chứng, được tiêm nước sinh lý, với ký hiệu TN11 đến TN13. Huyết thanh của lợn sau khi tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành trong máu sau khi tiêm vacxin 21 ngày
3.5.3.6. Phương pháp xác định liều vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi lợn
Nhằm xác định liều tiêm vacxin đa giá phòng bệnh viêm phổi ở lợn phù hợp để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau khi tiêm vacxin cao nhất và có độ dài miễn dịch dài nhất như sau: Lô lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm 3 nhóm khác nhau, mỗi nhóm lợn thí nghiệm có 5 lợn 6 tuần tuổi. Tiến hành tiêm cho lợn như sau:
- Nhóm 1: tiêm vacxin đa giá viêm phổi lợn 1 mũi với liều tiêm 2 ml/con tiêm bắp.
70
Bảng 4.12. Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh ở chuột của vi khuẩn
P. multocida TT Ký hiệu chủng Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số chuột chết (con) Thời gian chết chuột (giờ) Phân lập lại vi khuẩn 1 P4 2 0,2 Dưới da 2 20 2/2 2 P5 2 0,2 2 24 2/2
Kết quả ở bảng 4.12 cho thấy: 2 chủng P. multocida kiểm tra có độc lực mạnh đối với chuột nhắt trắng, có khả năng gây chết chuột thí nghiệm trong vòng 20 - 24 giờ sau khi tiêm. Tiến hành mổ khám những chuột chết quan sát thấy có những bệnh tích như: bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất huyết. Đây là bệnh tích thường gặp của chuột chết khi tiêm vi khuẩn P. multocida cường độc. Tiến hành phân lập lại vi khuẩn P. multocida từ máu tim của những chuột chết đều cho kết quả dương tính.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thu được cũng tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả như: Đỗ Quốc Tuấn (2008) cho biết vi khuẩn P. multocida phân lập được từ lợn ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam có độc lực gây chết chuột bạch từ 50 - 100% trong thời gian từ 20- 48 giờ;
Chúng tôi đã tiến hành xác định liều LD50 của vi khuẩn P. multocida nghiên cứu và đã xác định được liều LD50 của chủng P. multocida serotype A là 4 x 107
CFU/0,2 ml và serotype D là 4,2 x 107 CFU/0,2 ml.
4.2.3. Kết quả đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống sản xuất
vacxin phòng bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra
Giống S. suis trong bộ giống sản xuất vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển vacxin thuộc Công ty CP thuốc Thú y Marphavet được chúng tôi tiến hành giám định lại qua các đặc tính nuôi cấy trên một số môi trường đặc biệt, đặc tính sinh hóa, khả năng lên men đường. Sau đó tiến hành xác định serotype và một số yếu tố gây bệnh điển hình của các chủng vi khuẩn này. Từ những lô giống sản xuất, chúng tôi kiểm tra khả năng ổn định đặc tính sinh học của giống.
4.2.3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái
Kết quả kiểm tra đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái vi khuẩn S. suis
thể hiện ở hình 4.16.
Hình A: Khuẩn lạc của S. suis Hình B: Vi khuẩn S. suis trên kính hiển vi 1.000 lần (10x100)
Hình 4.16. Khuẩn lạc S. suis và hình thái vi khuẩn khi soi trên kính hiển vi
Kết quả cho thấy: chủng vi khuẩn S. suis kiểm tra đều bắt màu gram dương, vi khuẩn có hình cầu, hình bầu dục, xếp thành chuỗi như chuỗi hạt có độ dài ngắn không đều nhau, có khi chúng đứng thành từng cặp, có chỗ xếp thành các chuỗi ngắn có 6 - 10 vi khuẩn hoặc dài hơn. 100% các chủng kiểm tra mọc tốt trên môi trường thạch máu, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ, hơi vồng và sáng trắng, gây dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy.
4.2.3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa
Kết quả giám định một số đặc tính nuôi cấy, hình thái, đặc tính sinh hóa và khả năng lên men đường của chủng S. suis được lựa chọn dùng cho nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả như trình bày ở bảng 4.13.
- Chủng kiểm tra không phát triển trong môi trường NaCl 6,5% và âm tính với phản ứng KOH 3%.
- Chủng đều âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol.
- Chủng kiểm tra lên men các loại đường: Glucose, Galactose, Maltose, Lactose và không có chủng nào lên men các đường Mannitol, Sorbitol.
Như vậy có thể thấy chủng vi khuẩn này đều mang các đặc điểm đặc trưng của giống vi khuẩn S. suis như mô tả của Quinn & cs. (1994).
72
Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của giống sản xuất S. suis
TT Chỉ tiêu kiểm tra Số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ dương tính Quinnvà cs. (2004)
1 Gram dương 1 1 1/1 Gram dương
2 Dung huyết 1 1 1/1 + 3 KOH 3% 1 0 0/1 - 4 NaCl 6,5% 1 0 0/1 - 5 Indol 1 0 0/1 - 6 Oxidase 1 0 0/1 - 7 Catalase 1 0 0/1 - 8 Glucose 1 1 1/1 + 9 Galactose 1 1 1/1 + 10 Lactose 1 1 1/1 + 11 Maltose 1 1 1/1 +