3.5.1. Phương pháp nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của
lợn mắc bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. mutocida và S. suis gây ra
3.5.1.1. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis
Chọn 24 con lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh không tiêm vacxin viêm phổi có kháng nguyên A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Trước khi gây bệnh cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có trong máu lợn với A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis. Lợn được chia làm 8 lô, mỗi lô có 3 con. Liều gây bệnh bằng 100 liều LD50, với đường gây bệnh dưới da lợn. Lợn đối chứng được tiêm BHI broth vô trùng. Theo TCVN 8685.
- Lô 1: gây bệnh với vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2 - Lô 2: gây bệnh với vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5 - Lô 3: gây bệnh với vi khuẩn P. multocida serotype A
- Lô 4: gây bệnh với vi khuẩn P. multocida serotype D - Lô 5: gây bệnh với vi khuẩn S. suis serotype 2
- Lô đối chứng: 3 lô, mỗi lô 3 con lợn
Theo dõi lợn gây bệnh thực nghiệm biến đổi về triệu chứng lâm sàng, mổ khám quan sát các biến đổi bệnh lý lâm sàng có so sánh với lợn bị mác bệnh viêm phổi do các vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis gây bệnh cho lợn ở các lứa tuổi tại thực địa.
3.5.1.2. Phương pháp PCR xác định các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis phân lập từ lợn gây bệnh thực nghiệm
a. Quy trình tách ADN tổng số
- Lấy một số khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch cho vào Eppendorf 2ml đã bổ sung 200 µl nước cất đã qua khử trùng. Vortex trong 30 giây.
- Cho thêm 180 µl dung dịch Digestion Solution và 20 μL of Proteinase K Solution, lắc bằng máy vortex trong 30 giây cho đến khi thành huyễn dịch đồng nhất rồi ủ ở 56oC trong 3 giờ, cứ 30 phút vortex 1 lần.
- Bổ sung 20 μL RNase-A, lắc trong 30 giây, để ở ủ ở 56 oC trong 30 phút. - Thêm 200 μL of Lysis Solution, lắc trong 30 giây cho mẫu tan hoàn toàn. - Thêm 400 μL Ethanol 50o, lắc trong 15 giây; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm, loại bỏ phần dung dịch phía dưới.
- Cho 500 µl dung dịch Washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới.
- Cho 500 µl Washing buffer 2 (AW2) vào cột lọc để tiếp tục rửa DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1,5 phút, bỏ dịch bên dưới. Ly tâm lại 13.000 vòng/phút trong 2 phút làm khô màng.
- Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, cho 50 µl dung dịch Elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 4 - 5 phút; sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ cột, thu dịch bên dưới là ADN tổng số. Ghi ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 20 oC cho đến khi sử dụng.
b. Trình tự mồi xác định A. pleuropneumoniae
- Mồi sử dụng: cặp mồi của phản ứng được dựa vào chuỗi gen mã hóa omlA
(outer membrane lipoprotein) đặc trưng cho A. Pleuropneumoniae (Gram & cs., 1998), gồm một mồi xuôi LPF và một mồi ngược LPR, trình tự nucleotitide của cập mồi được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi dùng để xác định gen omlA của A. pleuropneumoniae
Gen đích Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Sản phẩm Nhiệt độ bắt cặp OmlA LPF AAGGTTGATATGTCCGCACC 950 bp 63oC LPR CACCGATTACGCCTTGCC c. Trình tự mồi xác định P. mutocilda
Trình tự mồi xác định các serotype giáp mô A, B, D của vi khuẩn
P. multocida dựa trên phản ứng PCR được mô tả bởi Đỗ Ngọc Thúy & cs. (2007) gồm các cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xác định serotype A, CAPB-F và CAPB-R để xác định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xác định serotype D. Trình tự cặp mồi và kích cỡ sản phẩm được trình bày ở bảng 3.2.
40
Bảng 3.2. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định serotype A, D của P. multocida
Tên mồi Trình tự mồi Độ
đặc hiệu Kích thước Nhiệt độ bắt cặp CAPA-F 5’- TGCCAAAATCGCAGTGAG-3’ Serotype A 1044 bp 54oC CAPA-R 5’- TTGCCATCATTGTCAGTG-3’ CAPB-F 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’ Serotype B 720 bp CAPB-R 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’ CAPD-F 5’- TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3’ Serotype D 657 bp CAPD-R 5’- CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3’ d. Trình tự mồi xác định S. suis
Mồi của phản ứng PCR: cặp mồi của phản ứng được thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá glutamate dehydrogenase (gdh) đặc trưng cho vi khuẩn S. suis, gồm 1 mồi xuôi là Str2-F và 1 mồi ngược là Str2-R, được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Trình tự mồi dùng để xác định gen gdh của S. suis theo tiêu chuẩn
quốc gia- TCVN 8400-2:2010
Gen
đích Ký hiệu mồi Trình tự cặp mồi (5’ - 3’)
Kích cỡ sản phẩm (bp)
Nhiệt độ bắt cặp
gdh Str2 - F (mồi xuôi) 5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’ 688 58oC
Str2 - R (mồi ngược) 5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’
e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng
Thành phần Thể tích (µl)
PCR Master Mix (Thermo) 25
Mồi xuôi (10pmol/µl) 2
Mồi ngược (10pmol/µl) 2
DMSO 2
Khuôn tổng số 3
Nước tinh khiết (của kit) 16
Tổng 50
Bảng 3.5. Chu trình nhiệt
Các giai đoạn phản ứng Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Khởi đầu 94 0C 5 phút 1
Biến tính 94 0C 30 giây
35
Gắn mồi Tùy cặp thuộc cặp mồi 30 giây
Kéo dài 72 0C 2 phút
Kết thúc 72 0C 10 phút 1
f.Điện di kiểm tra trên Agarose 1%:
Sử dụng 10 µl sản phẩm PCR, chạy 30 phút ở hiệu điện thế 110V, 100mA, nhuộm Ethidium Bromide 5 phút.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ổn định đặc tính sinh học
của giống sản xuất vacxin phòng bệnh do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis gây ra
3.5.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và kiểm tra đặc tính sinh vật, hoá học
Phương pháp giám định các đặc tính nuôi cấy trên các loại môi trường, đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida
và S. suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) và theo TCVN- 8685. Bệnh phẩm là phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng được cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu hoặc môi trường thạch chọn lọc Colombia. Sau khi nuôi cấy trong tủ ấm có 5% CO2, có thể chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn về mặt hình thái và đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685.
3.5.2.2. Phương pháp PCR kiểm tra yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn
a. Quy trình tách ADN tổng số:
Thực hiện theo mô tả ở phần 3.5.1.2.a
b. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của A. pleuropneumoniae
- Xác định gen sản sinh độc tố (Apx) của vi khuẩn A. pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR theo (Frey & cs., 1995):
Bảng 3.6. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định gen quy định sản sinh ba
loại độc tố Apx của A. pleuropneumoniae
Gen đích Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5’- 3’) Sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp
apxICA XICA-F TTGCCTCGCTAGTTGCGGAT 2420
62oC
XICA-R TCCCAAGTTCGAATGGGCTT
apxIICA XIICA-F CCATACGATATTGGAAGGGCAAAT 2088
XIICA-R TCCCCGCCATCAATAACGGT
apxIIICA XIIICA-F CCTGGTTCTACAGAAGCGAAAATC 1755
XIIICA-R TTTCGCCCTTAGTTGGATCGA
apxIBD XIBD-F GTATCGGCGGGATTCCGT 1447
XIBD-R ATCCGCATCGGCTCCCAA
apxIIIBD XIIIBD-F TCCAAGCATGTCTATGGAACG 968
XIIIBD-R AACAGAATCAAAATCAGCTTGGTT
c. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực của P. multocida
42
d. Trình tự mồi xác định yếu tố độc lực và serotype của S. suis
Việc xác định 4 yếu tố gây bệnh của S. suis được thực hiện bằng phản ứng Multiplex PCR. Về nguyên tắc, phương pháp này được thực hiện tương tự như phương pháp PCR để xác định vi khuẩn S. suis, chỉ khác về thành phần của phản ứng và các chu kỳ nhiệt.
Bảng 3.7. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định một số gen mã hoá
các yếu tố độc lực của S. suis
Gen đích Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) Sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp epf epf-F epf-R CGCAGACAACGAAAGATTGA AAGAATGTCTTTGGCGATGG 744 62oC sly sly-F sly-R GCTTGACTTACGAGCCACAA CCGCGCAATACTGATAAGC 248 mrp mrp-F mrp-R ATTGCTCCACAAGAGGATGG TGAGCTTTACCTGAAGCGGT 188 arc arcA-F arcA-R TGATATGGTTGCTGCTGGTC GGACTCGAGGATAGCATTGG 118
Bốn serotype S. suis gây bệnh thường gặp nhất ở lợn là serotype 1, 2, 7 và 9 được xác định bằng phản ứng PCR.
Mồi của phản ứng: các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 của S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps1J-F và cps1J-R để xác định serotype 1, cps2J-F và cps2J-R để xác định serotype 2, cps7H-F và cps7H-R để xác định serotype 7, cps9H-F và cps9H-R để xác định serotype 9.
Bảng 3.8. Trình tự các mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7, 9 của S. suis
Serotype Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide (5 ’- 3 ’) Sản phẩm (bp) Nhiệt độ bắt cặp 1 cps1J-F cps1J-R TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T
TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A 637
2 cps2J-F
cps2J-R
TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG
TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC 498
7 cps7H-F
cps7H-R
AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG
TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA 379 62
oC
9 cps9H-F
cps9H-R
GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT
e. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phương pháp PCR:
Thực hiện theo thao tác đã mô tả ở phần 3.5.1.2.e
f.Điện di kiểm tra trên Agarose 1%:
Thực hiện như đã mô tả ở phần 3.5.1.2.f
3.5.2.3. Phương pháp kiểm tra yếu tố độc lực của vi khuẩn trên chuột và lợn
Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis trong nghiên cứu này, được xác định trên chuột nhắt trắng và trên lợn. Xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938). Với mỗi chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng được nuôi cấy ở 37◦C/24 giờ, riêng với A. pleuropneumoniae nuôi cấy trong điều kiện có 5% CO2
mỗi một chủng vi khuẩn được tiêm cho 2 chuột thí nghiệm vào dưới da với liều 0,2 ml/con. Với lợn, mỗi lợn được gây bệnh thực nghiệm ở liều 5 ml/con (Theo TCVN 8685).
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin đa giá vô hoạt nhũ
dầu phòng bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis gây ra
3.5.3.1. Phương pháp chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu
Giống gốc master seed được lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển
vacxin gồm: vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 2, 5a và 5b; Vi khuẩn
P. multocida serotype A và D; vi khuẩn S. suis serotype 2. Bộ giống gốc này đang được sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh viêm phổi cho lợn, đã được phép lưu hành trên toàn quốc. Các vi khuẩn của bộ giống gốc này có cấu trúc kháng nguyên ổn định, kháng nguyên tính cao, sản sinh các loại độc tố và độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015).
Các chủng vi khuẩn được lưu giữ dưới dạng đông khô hay thạch lỏng Glycerol (Phần phụ lục).
- Lấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ thạch lỏng (hoặc ống giống đã đông
khô) nuôi cấy trên môi trường thạch PPLO có bổ sung NAD; Vi khuẩn
P. multocida và S. suis nuôi cấy trên môi trường thạch máu, để ở 370C, với
A. pleuropneumoniae trong điều kiện có 5% CO2 trong 24 giờ.
- Chọn khuẩn lạc A. pleuropneumoniae trên thạch PPLO; Vi khuẩn
44
hay TSB (giống nhỏ), nuôi cấy lắc ở 370C, trong 6 giờ. Chuyển canh trùng đã nuôi cấy lắc: từ 100 ml canh trùng chuyển vào bình có 200 ml TYE, nuôi cấy lắc ở 370C, trong 10 giờ…vv, tóm tắt ở sơ đồ (hình 3.1).
Ghi chú: - TW: Tryptone Water
- PLLO: Pleuropneumonia-like organism - BHI: Brain Heart Infusion
- TYE: Tryptone Yeast Extract Broth - TSB: Tryptic Soy Broth
- THB: Todd Hewitt Broth
Hình 3.1. Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu
Kiểm tra an toàn Bộ giống gốc
Thạch máu, thạch PPLO, BHI
Giống nhỏ: TYE, TSB, THB
Giống sản xuất: TYE, TSB, THB
Lên men sục khí: TW, TSB, THB
Vô hoạt bằng formol 0,3%
Bổ sung nhũ dầu 25%
Dán nhãn thành phẩm Ra chai bán thành phẩm
Kiểm tra vô trùng Kiểm tra hiệu lực
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra thuần khiết
Đếm số và kiểm tra thuần khiết
Kiểm tra vô trùng
3.5.3.2. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết, vô trùng
Kiểm tra cảm quan, đậm độ và vô trùng: vacxin được kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685- 2017 và theo quy trình của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia.
3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Kiểm tra an toàn: vacxin được kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng bằng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con. Bên cạnh đó vacxin cũng được kiểm tra an toàn trên lợn bằng cách tiêm vacxin liều gấp đôi (4 ml/con) cho lợn 4 tuần tuổi với đường tiêm bắp. Theo dõi các phản ứng của chuột nhắt và lợn để xem mức độ an toàn của vacxin thử nghiệm.
3.5.3.4. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực
a.Kiểm tra trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp thay thế: Thí nghiệm được bố trí thành 3 lô:
- Lô 1: Chia 2 nhóm, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 15 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da, lặp lại mũi 2 sau 7 ngày và nhóm đối chứng gồm 15 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (LD50 = 4,8 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.
- Lô 2: Chia 2 nhóm, cách tiêm như lô 1, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 10 chuột và nhóm đối chứng 10 chuột được tiêm nước thịt vô trùng. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn P. multocida
(LD50 = 4,2 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. - Lô 3: Chia 2 nhóm, cách tiêm như ở lô 1 và 2, nhóm thí nghiệm tiêm vacxin cho 5 chuột, nhóm đối chứng 5 chuột được tiêm nước thịt vô trùng Sau 21 ngày, tiến hành thử thách công cường độc với liều 10LD50 của vi khuẩn S. suis (LD50 = 4,4 x 107 CFU/0,2 ml) cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng.
b. Kiểm tra hiệu lực trên lợn bằng phương pháp trọng tài:
Vacxin được kiểm tra phải có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 70% khi công cường độc. Lợn thí nghiệm là lợn khỏe mạnh, trên 4 tuần tuổi, không
nhiễm mầm bệnh tự nhiên (âm tính với kháng thể kháng A. pleuropneumoniae,
P. multocida và S. suis). Thí nghiệm được tiến hành chia lô và tiêm vacxin cho lợn như sau:
+ Lô thí nghiệm: 21 lợn, đánh số tai từ TN1 đến TN21, tiêm vacxin liều sử dụng 2 ml/con, tiêm bắp.
46
+ Lô đối chứng: 14 lợn, đánh số tai ĐC1 đến ĐC14, tiêm nước thịt vô trùng, liều tiêm và đường tiêm tương tự lô thí nghiệm.
Sau 21 ngày tiêm vacxin và nước thịt vô trùng, công cường độc cho lợn ở lô thí nghiệm và lô đối chứng bằng cách tiêm 7 chủng vi khuẩn cường độc tiêu chuẩn vào dưới da, mỗi chủng vi khuẩn cho 3 lợn ở lô thí nghiệm và 2 lợn ở lô đối chứng, liều 5ml/con, tương đương với liều gây bệnh thực nghiệm là 4,5 x 109 vi khuẩn/ml đối với từng loại vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis.
3.5.3.5. Phương pháp đánh giá kiểm tra kháng thể
Hiệu giá kháng thể chống vi khuẩn A. pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b);
P. multocida (serotype A, serotype D) và S. suis serotype 2 được xác định dựa vào