2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong khoảng 10 tháng, từ tháng 10/2018 đến tháng 8/2019.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Thu mẫu nước, ghi nhận các thông số môi trường nước tại sông Lò Vôi, nơi có nhiều hoạt động nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là nuôi hàu.
- Nghiên cứu phân lập và sự sinh trưởng của tảo được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học – Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên – Trường Đại học Sài Gòn.
- Các nghiên cứu thực nghiệm mô hình nhân nuôi liên tục sinh khối tảo sẽ được phối hợp với Trung tâm thực nghiệm Nông – Lâm Hào Võ, thuộc Ban quản lí Rừng phòng hộ Cần Giờ.
2.2. Phương pháp nghiên cứu tảo 2.2.1. Thu mẫu 2.2.1. Thu mẫu
Dùng lưới thu mẫu phiêu sinh (mô hình vợt, kéo theo đuôi tàu để vớt mẫu tảo theo bề rộng, hoặc buộc vật nặng thả xuống nước để vớt mẫu theo độ sâu.
Mỗi mẫu thu được 100 ml, cho vào bình chứa bằng nhựa.
Mẫu dùng để phân lập tảo được giữ nguyên trong bình, trữ tạm ở nhiệt độ lạnh (thùng nước đá), đưa về phòng thí nghiệm lưu trữ trong điều kiện phù hợp [25].
2.2.2. Phân lập
Hiện nay, phân lập tế bào đơn lẻ bằng micropipette là phương pháp được dùng phổ biến nhất trong phân lập vi tảo. Dụng cụ chính là pipette Pasteur hay ống mao dẫn thuỷ tinh. Đầu tiên, hút tế bào từ mẫu quan sát, đặt tế bào này vào một giọt nước vô trùng sao cho không bị tổn thương, sau đó hút tế bào này chuyển qua một giọt nước vô trùng khác. Lặp lại thao tác này nhiều lần cho đến khi thu được một tế bào tảo riêng lẻ, loại bỏ được hoàn toàn các yếu tố khác, đủ tiêu chuẩn để đưa vào môi trường nuôi cấy.Giữ tế bào đích lại, loại bỏ các tế bào khác ra khỏi môi trường. Cách này giúp hạn chế làm tổn thương tế bào đích. Khi các tế bào tạp nhiễm đã được loại bỏ, tiến hành hút tế bào đích chuyển qua môi trường tăng trưởng phù hợp (Hình 2.2) [5], [26].
Hình 2.2. Kĩ thuật phân lập vi tảo [26] (G) Chuẩn bị micropipette từ pipepette Pasteur;
(H) Dùng micropipette để phân lập vi tảo hoặc các tế bào khác ra khỏi tế bào đích. a. Một tay cầm pipette, một tay cầm kẹp, nung đều pipette trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó tập trung nung cho đầu pipette nóng chảy.
b. Lấy pipette ra khỏi ngọn lửa và dùng kẹp kéo đầu pipette dài thành một ống nhỏ. c, d, e, f. Để ống nguội trong vài giây rồi cắt bỏ đầu ngoài cùng của đoạn ống vừa kéo dài, sao cho đầu ống tròn và trơn.
2.2.3. Nuôi thích nghi
Mẫu vi tảo sau khi phân lập được nuôi trong môi trường dùng cho tảo silic, là nước biển tự nhiên có bổ sung các thành phần khoáng chất và vitamin theo công thức F/2 [27]. Mẫu phân lập được cho vào bình tam giác, lượng môi trường và mẫu không quá 30 % dung tích bình. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ điều chỉnh sao cho gần với điều kiện tự nhiên. Chu kì sáng tối là 12:12, pH môi trường khoảng 7,4 – 8,3. Mẫu vi tảo được nuôi cho đến khi thích nghi ổn định với điều kiện thí nghiệm, rồi tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy nghiên cứu sinh lí [28].
2.2.4. Định danh hình thái Quan sát hình thái tế bào Quan sát hình thái tế bào
Tế bào vi tảo được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở bội giác khác nhau (X10, X40).
Quan sát đặc điểm tế bào ở các pha tăng trưởng về màu sắc tế bào, kích thước tế bào, sự phân chia tế bào.
Định danh bằng quan sát hình thái
Mẫu vi tảo được chụp dưới kính hiển vi quang học và ảnh điện tử SEM đối chiếu với các mô tả hình thái của Trương Ngọc An [2] để định loại đến chi trong hệ thống phân loại.
Làm sạch vật chất hữu cơ [25]
Chuẩn bị khoảng 10 ml mẫu phụ rót vào bình tam giác thủy tinh 100 ml.
Mẫu tảo silic Chaetoceros sp. được làm sạch chất hữu cơ bằng cách xử lí với dung dịch H2O2 30% và dung dịch HCl 10%, tiếp tục rửa mẫu lần cuối cùng bằng NH4Cl 1%, để khô ở nhiệt độ phòng và cố định mẫu bằng keo Naphrax của Sigma- Aldrich [29]. Quan sát hình dạng mảnh vỏ, đo các kích thước các mảnh vỏ từ các ảnh chụp dưới kính hiển vi quang học hoặc ảnh SEM.
Thêm 1 ml HCl 10 % để loại trừ CaCO3. Thêm vào 2 ml H2SO4 và 10 ml dung dịch KMnO4 bão hòa, sau đó đậy lọ bằng giấy parafilm, thỉnh thoảng lắc nhẹ mẫu.
Sau 24 giờ, bổ sung 10 ml axit oxalic bão hoà, nhỏ từng ml một, lắc nhẹ, bọt khí sẽ xuất hiện và dung dịch mẫu sẽ trong dần lên, nếu mẫu chưa trong, có thể bổ
sung từng ml một dung dịch axit oxalic bão hoà, để yên mẫu trong vài phút, mẫu sẽ trong. Sau đó mẫu sẽ được li tâm 3 lần, mỗi lần 20 phút với tốc độ 3000 vòng/phút.
Nước cất sẽ được dùng để rửa mẫu khi li tâm, cuối cùng các tế bào Tảo Silic sẽ lắng đáy ống li tâm, loại bỏ nước cất để chỉ còn vài ml.
2.2.5. Định danh phân tử tảo Chaetoceros sp. bằng mã vạch DNA - Chuẩn bị dụng cụ - Chuẩn bị dụng cụ
Bình tam giác 1000 ml, 500 ml, 250 ml, lọ thủy tinh đựng hóa chất, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu… được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó tráng lại thật sạch với nước cất, đậy nút bông, hấp ở nhiệt độ 1210C, 1atm, trong thời gian 30 phút sau đó sấy ở nhiệt độ 1200C, trong thời gian 30 phút. Các dụng cụ khác như đầu tuýp, eppendorf, micropipette, thùng xốp, giá đựng eppendorf, hộp đựng eppendorf, hộp đựng đầu tuýp, giấy nhôm, băng keo hấp khử trùng, băng keo giấy, bút lông dầu, kéo, kẹp, giấy báo tạp chí, đèn cồn,…được vệ sinh sạch sẽ.
Hình 2.3. Thiết bị thu sinh khối tảo - Chuẩn bị tảo
Tảo silic được chọn có tốc độ sinh trưởng cao, năng suất quang hợp cao, có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, tế bào tảo ở trạng thái huyền phù, không kết dính vào thành và đáy bình nuôi cấy. Dịch vi tảo thuần chủng được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tế bào vi tảo có màu vàng nâu,
không bị hoại tử, gãy góc, vón cục. Vi tảo được nuôi trong bình tam giác 250 ml, lượng môi trường và mẫu không quá 30% dung tích bình sau đó đặt vào phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 22 - 240C, quan sát hằng ngày.
- Thu sinh khối và lưu giữ tảo
Mẫu tảo được lọc qua giấy lọc Whatman đường kính 47 mm bằng máy hút chân không. Sau đó, mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ -30oC cho đến khi xử lí.
- Tách chiết DNA tổng số [30]:
DNA tổng số tách chiết từ mẫu tảo silic Chaetoceros sp. được thực hiện theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) với một số cải tiến nhỏ:
Bước 1: Đặt mẫu lọc vào cối, thêm 1 ml dung dịch đệm chiết và nghiền mạnh.
Tiếp tục thêm 1 ml dung dịch đệm chiết và nghiền. Chuyển vào 4 eppendorf (2 ml). Rửa cối bằng 1 ml dung dịch đệm chiết rồi chia đều vào 4 eppendorf. Cho các mẫu vào bể ủ ở nhiệt độ 600C trong 30 phút và đảo nhẹ mẫu sau mỗi 10 phút.
Bước 2:Sau 30 phút bổ sung một lượng dung dịch chloroform với tỉ lệ 1:1 vào
mỗi eppendorf, đảo đều mẫu trong 5 phút. Ly tâm các mẫu trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C. Thu phần dịch trong phía trên chứa DNA (thể tích từ 500 - 800 µl) chuyển sang eppendorf mới.
Bước 3: Cho một lượng isopropanol tương đương thể tích với dịch trong vừa
chuyển, đảo nhẹ sau đó ủ ở nhiệt độ -200C từ 2 đến 3 giờ. Sau thời gian ủ tiến hành ly tâm các mẫu trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C, sau đó loại bỏ phần dịch nước (cẩn thận không làm trôi phần DNA dưới đáy eppendorf).
Bước 4: Rửa DNA bằng 500 µl dung dịch cồn 70%, ủ trong 30 phút, ở nhiệt độ
100C. Sau khi ủ tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút, trong vòng 15 phút, ở nhiệt độ 40C, loại bỏ dung dịch cồn. Để khô các mẫu ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thu hồi các mẫu vào một eppendorf bằng 80 µl dung dịch đệm TE.
- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra DNA tổng trên gel điện di. Độ tinh sạch còn thể hiện qua tỉ số hấp thụ của hai bước sóng 260/280. Nếu đạt từ 1,8 – 2,0 là đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch cho phản ứng PCR [31].
Theo Min-Ah Lee và cộng sự (2013), cây phát sinh được suy ra từ dữ liệu gen
SSU, LSU và rbcL cho thấy các loài thuộc cùng một chi, tức xác định chính xác phân
loại đến chi. Tuy nhiên, một chi có nhiều loài, lúc này các loài cần được xác định rõ ràng thì trình tự gen SSU và rbcL độ tin cậy chưa cao, nhưng trình tự trên gen LSU có thể được bảo tồn cao trong một thời gian dài, làm cho cây phát sinh gen do LSU tạo ra đáng tin cậy [32]. Round et al. (1990) và Kaczmarska et al. (2006) đã báo cáo kết quả tương tự. Những kết quả này cho thấy rằng vùng gen LSU D1 - D3 thể hiện chính xác các mối quan hệ phát sinh gen của diatoms trung tâm, và gen này có thể được coi là một maker phân tử phù hợp.
Để xác định chính xác vị trí phân loại của Chaetoceros sp. 2 gen rbcL – 3P và
LSU D1-D3 được chọn để khuếch đại trình tự.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu CfD và DP rbcL7 (Hình 2.4) nhằm khuếch đại trình tự vùng gen rbcL-3P bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR major cycler, model cycler- 25, USA.
Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen rbcL-3P [33] Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện với tổng thể tích 25 µL (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự rbcL-3P
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Taq Mix 12,5 2 Mồi CfD 1 3 Mồi DP rbcL7 1 4 DNA khuôn 1 5 Nước cất vô trùng 9,5 Tổng thể tích 25
- Khuếch đại gen chỉ thị LSU D2-D3 bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu T16U và T24U (Hình 2.5) nhằm khuếch đại trình tự vùng gen LSU D2-D3 bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR major cycler, model cycler- 25, USA [33].
Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen LSU D2-D3 [33] Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện với tổng thể tích 25 µl (Bảng 2.2)
Bảng 2.2. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự LSU D2-D3
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Taq Mix 12,5 2 Mồi T16U 1 3 Mồi T24U 1 4 DNA khuôn 1 5 Nước cất vô trùng 9,5 Tổng thể tích 25
Hút các thành phần Taq Mix, cặp mồi, DNA khuôn và nước cất vô trùng cho vào các eppendorf 0,2 ml. Huyền phù nhẹ nhàng để hoà trộn đều các thành phần phản ứng, sau đó li tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf vào các khuôn ủ nhiệt của máy PCR. Tiến hành chạy chương trình nhiệt để thực hiện phản ứng khuếch đại trình tự
LSU D2-D3 (Bảng 2.3).
- Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị gel: cân 0,3 g agarose rồi thêm vào 30 ml dung dịch đệm TE 1X (Tris - HCl - EDTA), đun hỗn hợp đến khi tan hoàn toàn, khuấy đều và làm nguội rồi cho vào khuôn đã gắn lược, để yên khoảng 30 phút cho gel đông.
Đặt khuôn gel vào bể điện di có chứa TE 1X sao cho dung dịch đệm ngập trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản gel đặt về phía cực âm.
DNA tổng số được chiết xuất và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng việc chạy điện di với agarose gel 1% ở 90V, I = 3A, thời gian 45 phút trong dung dịch đệm TE 1X.
Bảng 2.3. Chu kì nhiệt khuếch đại trình tự
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 95oC 2 phút 1 Biến tính 94oC 20 giây 35 Bắt cặp 50oC 30 giây Kéo dài 72oC 2 phút Kết thúc 72oC 7 phút 1 - Giải trình tự và hiệu chỉnh
Sản phẩm PCR nhân bản thành công gen LSU D2-D3 và rbcL-3P sẽ được gửi đi giải trình tự hai chiều (với mồi xuôi và mồi ngược) tại công ty First BASE, địa chỉ 7-3, Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, 43300 Seri Kembangan, Selangor, Malaysia.
Kết quả giải trình tự gen được hiệu chỉnh bằng Multiple Sequence Alignment (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle), trình tự đồng nhất (consensus sequence) được rút ra từ hai kết quả giải trình tự và kiểm tra các sai lệch. Trình tự gen này sẽ được so sánh và sắp xếp (alignment) bằng thuật toán Clustal W. Sau đó, các trình tự được so sánh với dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng công cụ giải thuật so sánh các chuỗi sinh học (BLAST) để định danh loài Chaetoceros sp.
Cây phát sinh loài được xây dựng trên phương pháp Maximum – Likelihood, phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (resampling) bằng phần mềm MEGA 6.0 [32].
2.2.6. Phương pháp xác định mật độ tế bào vi tảo
- Sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer cải tiến.
Buồng đếm hồng cầu Neubauer cải tiến có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và độ sâu buồng đếm là 0,1 mm. Đếm số lượng tảo có trong 4 ô lớn (Hình 2.5).
Hình 2.6. Thiết bị buồng đếm hồng cầu xác định mật độ tảo
Lấy mẫu định lượng tảo lúc 9h sáng. Đếm tảo bằng buồng đếm hồng cầu Neubaucer:
Lắc đều mẫu tảo Chaetoceros sp. dùng micropipette hút mẫu tảo cho vào buồng đếm hồng cầu hiệu neubauer improved của Đức, chờ lắng 2 phút, sau đó đưa và thị trường kính hiển vi quang học Zeiss ở bội giác X10 và X40, mỗi mẫu đếm 3 lần. Phương pháp dựa trên cơ sở đếm số tế bào có mặt trong một thể tích xác định. Buồng đếm hồng cầu có độ sâu 0,1 mm và diện tích ô vuông nhỏ nhất 0,0025 mm2. Tổng số tế bào đếm được trong các lần đếm dùng để tính mật độ (theo công thức 2.1) [34]:
D=n/i x 104 (tb/mm) (2.1)
n: Tổng số tế bài đếm được i: Số lần đếm
Mật độ tảo (tb/cm2) = Số tế bào đếm được ở 5 ô/5 x 25 ô x 104 (2.2)
2.2.7. Thiết lập mối tương quan giữa mật độ tế bào và mật độ quang
Phương pháp đo mật độ quang (OD) còn được gọi là phương pháp đo độ hấp thụ hoặc độ đục, giúp xác định mật độ tế bào trong các nghiên cứu sinh lí cũng như xác định sự tăng trưởng qua các pha của vi tảo. Đây là phương pháp gián tiếp cho
thấy sự tương quan giữa mật độ vi tảo với độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng cụ thể. Phương pháp đếm tế bào tốn thời gian, do đó đo mật độ quang là một phương pháp nhanh và hiệu quả. Lượng ánh sáng được hấp thụ bởi dịch huyền phù tế bào có thể liên quan trực tiếp đến sinh khối hoặc số lượng tế bào [35].
Hình 2.7. Thiết bị đo hiệu suất lượng tử tối đa của quang hệ II
Chọn môi trường nuôi tảo có chất lượng tốt, có độ đồng đều cao, ít bị lắng kết, có độ sánh, đem pha loãng. Đo mật độ quang ở bước sóng 680 nm. Sau đó tiến hành đếm số lượng tế bào trên buồng, đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào tảo trên 1ml môi trường nuôi ở các mẫu pha loãng tương ứng. Tiến hành như vậy với 2 mẫu tảo.
Lập bảng tương ứng giữa mật độ quang và mật độ tế bào đo được, sau đó thiết lập đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Do mật độ của tế bào tỉ lệ thuận với độ đục của môi trường hay tỉ lệ với mật độ quang của mẫu đó, vì vậy đường tuyến tính có dạng đường thẳng và đi qua gốc tọa độ. Môi trường so sánh khi đo mật độ quang là môi trường pha nuôi tảo.
Phương trình tuyến tính:
y = ax + R2 (2.3)
Trong đó: a là hệ số góc, R2 là sai số khi đo.
2.2.8. Xác định thời gian thế hệ và tốc độ tăng trưởng
Khi môi trường nuôi cấy thuận lợi và đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho