a. Tách chiết DNA tổng số
Để có thêm những thông tin phân tử phục vụ định danh loài tảo thuộc chi
Chaetoceros đã được phân lập, DNA tổng số của loài tảo này đã được tách chiết và
thực hiện điện di và kiểm tra chất lượng. Mẫu DNA tổng số được bảo quản ở -30 ºC để sử dụng về sau.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy DNA tổng số là một băng sáng rõ, sắc nét và ít bị đứt gãy, không có nhiều smear (Hình 3.3)
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số của Chaetoceros sp.
Kết quả đo OD bằng máy Nanodrop cũng cho thấy mẫu DNA tổng số có độ tinh sạch cao, tỉ số hấp thụ của hai bước sóng 260/280 là 1.8 (Hình 3.4), đủ tiêu chuẩn chất lượng cho việc tiến hành các phản ứng PCR.
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng Nanodrop
b. Khuếch đại các mã vạch rcbL-3P và LSU D2-D3 bằng kĩ thuật PCR.
Dựa vào kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy sản phẩm PCR của vùng gen rbcL-3P (mã vạch DNA sơ cấp) của tảo silic Chaetoceros sp. là một băng DNA sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí ở giữa băng 800 bp và 900 bp (Hình 3.5, băng số 2). Sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn gen LSU D2-D3 (mã vạch DNA thứ cấp) là một băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí băng 600 bp và 700 bp (Hình 3.5, băng số 3). Các sản phẩm PCR đều có kích thước phân tử phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến khi thiết kế mồi để khuếch đại. Như vậy, việc khuếch đại trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3 của tảo silic Chaetoceros sp. bằng kĩ thuật PCR đã thực hiện và có thể được sử dụng các sản phẩm PCR này để thực hiện giải trình tự trực tiếp bằng chính các mồi đã dùng để khuếch đại.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR của vùng gen rbcL 3P và LSU D2-D3
(1) Thang DNA 100kb. (2) Vùng gen rbcL- 3P. (3) Vùng gen LSU D2-D3.
c. Phân tích các kết quả giải trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3
Sau khi giải nhận kết quả giải trình tự thô, trình tự mồi sẽ được loại bỏ, loại bỏ thêm các vùng nhiễu do lỗi đọc trình tự nằm ở hai đầu, kết quả cuối cùng thu được về giải trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3 độ dài lần lượt là 866 bp và 615 bp. Kĩ thuật BLAST được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự truy vấn với các trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu Genbank.
Kết quả BLAST cho thấy trình tự vùng gen rbcL- 3P chỉ có độ tương đồng
khoảng 75-77% với các trình tham khảo của một số loài thuộc chi Chaetoceros trên Genbank (Hình 3.6), điều này mới chỉ có thể xác định đối tượng tảo silic nghiên cứu thuộc chi Chaetoceros.
Kết quả BLAST trình tự vùng gen LSU D2-D3 của Chaetoceros sp. cho thấy
mức độ tương đồng cao đến 99,55% so với trình tự Chaetoceros subtilis trên cơ sở dữ liệu Genbank (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả BLAST trình tự gen LSU D2-D3 trên GenBank
Như vậy chỉ thị mã vạch DNA thứ cấp (LSU D2-D3) đã giúp xác định chính xác hơn về sự tương đồng so với chỉ thị mã vạch DNA thứ cấp (rbcL-3P) ở loài
Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này và thể hiện sự tương đồng cao nhất với loài Chaetoceros subtilis.
d. Xây dựng cây phát sinh chủng loài dựa theo trình tự vùng gen LSU D2-D3
Sử dụng trình tự gen LSU của một số loài tảo thuộc chi Chaetoceros trên
GenBank để thực hiện xây dựng cây phát sinh chủng loài. Các trình tự này có chiều dài đủ theo yêu cầu là 615 bp và độ tương đồng từ 86,69% - 99,55% so với trình tự
Bảng 3.2. Kết quả BLAST vùng gen LSU D2-D3 các mẫu tương đồng trên cơ sở dữ liệu của GenBank
STT Tên loài Mức độ tương đồng di truyền Mã số trình tự trong GenBank 1 Chaetoceros subtilis 99,55% MG786437.1 2 Chaetoceros simplex 96,31% KC986089.1 3 Chaetoceros similis 93,12% KC986088.1 4 Chaetoceros cf. diadema 91,11% KC986070.1 5 Chaetoceros teres 87,16% KC986106.1 6 Chaetoceros didymus 86,69% KC986080.1
Hình 3.8. Mô hình cây phát sinh chủng loài của Chaetoceros sp. dựa vào trình tự vùng gen LSU D2-D3
Từ kết quả cây phát sinh chủng loài được xây dựng dựa trên trình tự vùng gen
LSU D2-D3 đã được thực hiện (Hình 3.8). Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài
cho thấy Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này có quan hệ gần gũi nhất với
Chaetoceros subtilis với độ tin cậy 100% và tạo thành 1 nhóm riêng trong cây phát
sinh loài. (Hình 3.8).
Từ kết quả định danh dựa vào hình thái, phân tích mã vạch DNA bằng kĩ thuật BLAST của hai vùng trình tự gen rbcL-3P và LSU D2-D3, kết quả phân tích phát sinh
chủng loài dựa trên trình tự LSU D2-D3, loài Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này được xác định là Chaetoceros subtilis. Những kết quả về phân tích hình thái, xây dựng mã vạch DNA cho loài tảo này đã đóng góp thêm nhiều thông tin, dữ liệu khoa học quan trọng. Sự kết hợp giữa phương pháp định danh truyền thống dựa vào hình thái với phương pháp định danh dựa vào mã vạch DNA đã cho thấy tính hiệu quả cao khi áp dụng để định danh loài tảo thuộc nhóm tảo silic. Các kết quả ban đầu đạt được trong nghiên cứu này có thể hướng tới áp dụng kỹ thuật mã vạch DNA trong nghiên cứu về sự đa dạng loài và ứng dụng của các loài tảo silic phân bố ven biển Việt Nam. Đối tượng tảo C. subtilis đã được quan tâm nghiên cứu về các đặc điểm sinh lí như ảnh hưởng kết hợp giữa N–NO3- và N–NH4+ lên sự tăng trưởng [38], tìm hiểu ảnh hưởng của một số kim loại nặng lên sự tăng trưởng, khảo sát ảnh hưởng của nitrogen và phosphor lên sự tăng trưởng [39], ảnh hưởng của nitrogen–ammonium lên sự sinh trưởng [22]. Tuy nhiên việc nhân nuôi sinh khối để phục vụ nuôi trồng thủy sản cho địa phương Cần Giờ thì chưa được quan tâm nhiều. Nghiên cứu sinh trưởng và thử nghiệm nhân sinh khối liên tục loài C. subtilis là rất cần thiết và có nhiều thách thức lớn, cần tiến hành từ quy mô phòng thí nghiệm đến thực nghiệm ngoài thực tế.