- Chuẩn bị dụng cụ
Bình tam giác 1000 ml, 500 ml, 250 ml, lọ thủy tinh đựng hóa chất, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống nghiệm, ống đong, phễu… được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó tráng lại thật sạch với nước cất, đậy nút bông, hấp ở nhiệt độ 1210C, 1atm, trong thời gian 30 phút sau đó sấy ở nhiệt độ 1200C, trong thời gian 30 phút. Các dụng cụ khác như đầu tuýp, eppendorf, micropipette, thùng xốp, giá đựng eppendorf, hộp đựng eppendorf, hộp đựng đầu tuýp, giấy nhôm, băng keo hấp khử trùng, băng keo giấy, bút lông dầu, kéo, kẹp, giấy báo tạp chí, đèn cồn,…được vệ sinh sạch sẽ.
Hình 2.3. Thiết bị thu sinh khối tảo - Chuẩn bị tảo
Tảo silic được chọn có tốc độ sinh trưởng cao, năng suất quang hợp cao, có khả năng chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, tế bào tảo ở trạng thái huyền phù, không kết dính vào thành và đáy bình nuôi cấy. Dịch vi tảo thuần chủng được thu ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng tảo là tốt nhất. Tế bào vi tảo có màu vàng nâu,
không bị hoại tử, gãy góc, vón cục. Vi tảo được nuôi trong bình tam giác 250 ml, lượng môi trường và mẫu không quá 30% dung tích bình sau đó đặt vào phòng nuôi cấy ở nhiệt độ 22 - 240C, quan sát hằng ngày.
- Thu sinh khối và lưu giữ tảo
Mẫu tảo được lọc qua giấy lọc Whatman đường kính 47 mm bằng máy hút chân không. Sau đó, mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ -30oC cho đến khi xử lí.
- Tách chiết DNA tổng số [30]:
DNA tổng số tách chiết từ mẫu tảo silic Chaetoceros sp. được thực hiện theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) với một số cải tiến nhỏ:
Bước 1: Đặt mẫu lọc vào cối, thêm 1 ml dung dịch đệm chiết và nghiền mạnh.
Tiếp tục thêm 1 ml dung dịch đệm chiết và nghiền. Chuyển vào 4 eppendorf (2 ml). Rửa cối bằng 1 ml dung dịch đệm chiết rồi chia đều vào 4 eppendorf. Cho các mẫu vào bể ủ ở nhiệt độ 600C trong 30 phút và đảo nhẹ mẫu sau mỗi 10 phút.
Bước 2:Sau 30 phút bổ sung một lượng dung dịch chloroform với tỉ lệ 1:1 vào
mỗi eppendorf, đảo đều mẫu trong 5 phút. Ly tâm các mẫu trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C. Thu phần dịch trong phía trên chứa DNA (thể tích từ 500 - 800 µl) chuyển sang eppendorf mới.
Bước 3: Cho một lượng isopropanol tương đương thể tích với dịch trong vừa
chuyển, đảo nhẹ sau đó ủ ở nhiệt độ -200C từ 2 đến 3 giờ. Sau thời gian ủ tiến hành ly tâm các mẫu trong 15 phút với tốc độ 8000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C, sau đó loại bỏ phần dịch nước (cẩn thận không làm trôi phần DNA dưới đáy eppendorf).
Bước 4: Rửa DNA bằng 500 µl dung dịch cồn 70%, ủ trong 30 phút, ở nhiệt độ
100C. Sau khi ủ tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút, trong vòng 15 phút, ở nhiệt độ 40C, loại bỏ dung dịch cồn. Để khô các mẫu ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thu hồi các mẫu vào một eppendorf bằng 80 µl dung dịch đệm TE.
- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA
Kiểm tra DNA tổng trên gel điện di. Độ tinh sạch còn thể hiện qua tỉ số hấp thụ của hai bước sóng 260/280. Nếu đạt từ 1,8 – 2,0 là đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch cho phản ứng PCR [31].
Theo Min-Ah Lee và cộng sự (2013), cây phát sinh được suy ra từ dữ liệu gen
SSU, LSU và rbcL cho thấy các loài thuộc cùng một chi, tức xác định chính xác phân
loại đến chi. Tuy nhiên, một chi có nhiều loài, lúc này các loài cần được xác định rõ ràng thì trình tự gen SSU và rbcL độ tin cậy chưa cao, nhưng trình tự trên gen LSU có thể được bảo tồn cao trong một thời gian dài, làm cho cây phát sinh gen do LSU tạo ra đáng tin cậy [32]. Round et al. (1990) và Kaczmarska et al. (2006) đã báo cáo kết quả tương tự. Những kết quả này cho thấy rằng vùng gen LSU D1 - D3 thể hiện chính xác các mối quan hệ phát sinh gen của diatoms trung tâm, và gen này có thể được coi là một maker phân tử phù hợp.
Để xác định chính xác vị trí phân loại của Chaetoceros sp. 2 gen rbcL – 3P và
LSU D1-D3 được chọn để khuếch đại trình tự.
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu CfD và DP rbcL7 (Hình 2.4) nhằm khuếch đại trình tự vùng gen rbcL-3P bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR major cycler, model cycler- 25, USA.
Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen rbcL-3P [33] Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện với tổng thể tích 25 µL (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự rbcL-3P
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Taq Mix 12,5 2 Mồi CfD 1 3 Mồi DP rbcL7 1 4 DNA khuôn 1 5 Nước cất vô trùng 9,5 Tổng thể tích 25
- Khuếch đại gen chỉ thị LSU D2-D3 bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu T16U và T24U (Hình 2.5) nhằm khuếch đại trình tự vùng gen LSU D2-D3 bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR major cycler, model cycler- 25, USA [33].
Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế mồi để khuếch đại trình tự gen LSU D2-D3 [33] Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện với tổng thể tích 25 µl (Bảng 2.2)
Bảng 2.2. Các thành phần có trong phản ứng khuếch đại trình tự LSU D2-D3
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Taq Mix 12,5 2 Mồi T16U 1 3 Mồi T24U 1 4 DNA khuôn 1 5 Nước cất vô trùng 9,5 Tổng thể tích 25
Hút các thành phần Taq Mix, cặp mồi, DNA khuôn và nước cất vô trùng cho vào các eppendorf 0,2 ml. Huyền phù nhẹ nhàng để hoà trộn đều các thành phần phản ứng, sau đó li tâm nhanh 15 giây rồi đặt các eppendorf vào các khuôn ủ nhiệt của máy PCR. Tiến hành chạy chương trình nhiệt để thực hiện phản ứng khuếch đại trình tự
LSU D2-D3 (Bảng 2.3).
- Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị gel: cân 0,3 g agarose rồi thêm vào 30 ml dung dịch đệm TE 1X (Tris - HCl - EDTA), đun hỗn hợp đến khi tan hoàn toàn, khuấy đều và làm nguội rồi cho vào khuôn đã gắn lược, để yên khoảng 30 phút cho gel đông.
Đặt khuôn gel vào bể điện di có chứa TE 1X sao cho dung dịch đệm ngập trên gel khoảng 1 cm, giếng lược của bản gel đặt về phía cực âm.
DNA tổng số được chiết xuất và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng việc chạy điện di với agarose gel 1% ở 90V, I = 3A, thời gian 45 phút trong dung dịch đệm TE 1X.
Bảng 2.3. Chu kì nhiệt khuếch đại trình tự
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 95oC 2 phút 1 Biến tính 94oC 20 giây 35 Bắt cặp 50oC 30 giây Kéo dài 72oC 2 phút Kết thúc 72oC 7 phút 1 - Giải trình tự và hiệu chỉnh
Sản phẩm PCR nhân bản thành công gen LSU D2-D3 và rbcL-3P sẽ được gửi đi giải trình tự hai chiều (với mồi xuôi và mồi ngược) tại công ty First BASE, địa chỉ 7-3, Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, 43300 Seri Kembangan, Selangor, Malaysia.
Kết quả giải trình tự gen được hiệu chỉnh bằng Multiple Sequence Alignment (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle), trình tự đồng nhất (consensus sequence) được rút ra từ hai kết quả giải trình tự và kiểm tra các sai lệch. Trình tự gen này sẽ được so sánh và sắp xếp (alignment) bằng thuật toán Clustal W. Sau đó, các trình tự được so sánh với dữ liệu của ngân hàng gen NCBI bằng công cụ giải thuật so sánh các chuỗi sinh học (BLAST) để định danh loài Chaetoceros sp.
Cây phát sinh loài được xây dựng trên phương pháp Maximum – Likelihood, phân tích bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (resampling) bằng phần mềm MEGA 6.0 [32].