Khi môi trường nuôi cấy thuận lợi và đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vi tảo, vi tảo sinh sản vô tính. Kích thước và sinh khối của các tế bào riêng lẻ tăng theo thời gian. Thời gian cần thiết để số lượng tế bào tăng gấp đôi
được gọi là thời gian nhân đôi hay thời gian thế hệ (td), vì đó là thời gian để tảo phát triển và tạo ra một thế hệ mới. Số lượng tế bào trong pha lũy thừa được mô tả như sau [35]:
2oNo -> 21No -> 22No -> 23No -> 2nNo (2.4) No = Số lượng tế bào ban đầu
n = Thế hệ
Mật độ tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng được dùng để tính tốc độ tăng trưởng trong khoảng thời gian đó (theo công thức 2.5) [29]:
ln (N - N )t o t o t t (2.5) µ: Tốc độ tăng trưởng (d-1)
tt và t0: hai thời điểm trên đường cong tăng trưởng Nt và N0: mật độ tế bảo ở hai thời điểm t và t0
Thời gian thế hệ (td) được tính theo công thức (2.6) [28]:
td= 0,6931/µ (2.6)
Thời gian phân chia mỗi ngày (Dd) được tính theo công thức [29]:
Dd=µ/0,6931 (2.7)
Năng suất sinh khối (BM) được tính theo công thức [36]:
t o t o N N BM t t (2.8) 2.2.9. Xác định độ mặn và pH của dịch nuôi
Độ pH, độ mặn, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy được đo hàng ngày bằng khúc xạ kế.
Hình 2.8. Thiết bị đo độ mặn nước
pH của môi trường nuôi cấy được đo hằng ngày vào lúc 9 giờ bằng đầu dò cầm tay ECO TESTR pH2 của EUTECH- singapore , độ chính xác 0,1 (Hình 2.9).
Hình 2.9. Thiết bị đo pH 2.2.10. Bố trí thí nghiệm tại phòng thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm Sinh học, được thiết kế đặc biệt và có đầy đủ các thiết bị phục vụ cho việc nuôi sinh khối tảo, khảo sát các đặc điểm sinh trưởng và sinh lí.
Khảo sát nồng độ phân bón NPK phù hợp với sự phát triển của tảo Chaetoceros sp. đã được định danh, được thực hiện với môi trường đối chứng là nước biển tự nhiên qua xử lí, môi trường nước biển tự nhiên qua xử lí có bổ sung phân bón NPK với các hàm lượng: 1mg/l; 1,25mg/l; 2mg/l; 5mg/l; 10mg/l; 15mg/l; 20mg/l và môi trường F/2. Tảo silic Chaetoceros sp. được cấy theo phương pháp mẻ bán liên tục trong các bình tam giác 250 ml, chứa 100 ml mẫu với môi trường nuôi cấy. Các bình tam giác được đậy kín bằng nút bông không thấm, phủ kín bên ngoài nút bằng giấy nhôm, hấp vô trùng trước khi sử dụng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.11. Thiết kế ao nuôi tảo liên tục ngoài trời
Xây dựng ao lắng thông với nguồn nước từ sông Lò Vôi.
Xây dựng ao nuôi ngoài tự nhiên, tại Trung tâm Thực nghiệm Hào Võ, có kích thước dài 4m, rộng 3m, sâu 1,2m, lót bạt nilong đen.
2.2.12. Môi trường dinh dưỡng nuôi thực nghiệm
Môi trường dinh dưỡng nuôi thực nghiệm được chọn là môi trường có nồng độ NPK có mật độ tối đa cao nhất trong quá trình nuôi trong phòng thí nghiệm.
Phân bón NPK được chọn để pha dung dịch nuôi cấy là phân bón Đầu Trâu NPK của công ty cổ phần phân bón Bình Điền có công thức N : P : K = 20 : 20 :15
Hình 2.10. Phân bón NPK
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Các số liệu được thu trực tiếp trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong ba lần, số liệu được thống kê xử lí bằng Exel 2016, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Dữ liệu được phân tích bằng phép phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA) trên phần mềm SPSS 20.0 (mức ý nghĩa α = 0,05).
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và định danh
3.1.1. Phân lập và định danh loài Chaetoceros dựa vào hình thái
Từ mẫu nước mặt sông Lò Vôi, thu vào ngày 15 tháng 10 năm 2018, một chủng tảo silic có hình dạng khá giống với những đặc điểm của chi tảo Chaetoceros đã được phân lập, làm thuần và lưu giữ trong phòng nuôi cấy tảo của Đại học Sài Gòn, nhiệt độ duy trì từ 24 – 25oC, ánh sáng 1500 lux, quang chu kì 12/12.
Các quan sát loài tảo này dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10X và 40X cho thấy các tế bào tảo được nối với nhau thành chuỗi thẳng, ngắn. Phía đầu chuỗi, các tế bào to hơn so với ở phía cuối chuỗi (Hình 3.1A). Mặt vỏ của tế bào đầu chuỗi vồng lên hình chỏm cầu trong khi đó mặt vỏ ở cuối chuỗi lõm hẳn vào trong. Mặt vỏ rộng hình chữ nhật, không thấy rõ đai nối, trục cao của tế bào thường dài hơn so với trục dài. Các lông gai mảnh, thẳng và ngắn, mọc ở mép vỏ, có sự giao chéo với lông gai của tế bào bên cạnh trong cùng chuỗi. Các tế bào thường có một thể sắc tố dạng tấm khá to (Hình 3.1B).
A B
Hình 3.1. Tảo Chaetoceros sp. qua kính hiển vi quang học
(A) Tảo Chaetoceros sp. qua kính hiển vi quang học (10X), (B) Tảo Chaetoceros sp. qua kính hiển vi quang học (40X)
Những quan sát dưới kính hiển vi quang học được cũng cố thêm bằng cánh thực hiện quan sát mảnh vỏ của loài tảo dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Các ảnh SEM cho thấy các tế bào có hình bầu dục, gồm 2 mảnh vỏ nối với nhau ở vị trí trung tuyến (Hình 3.2 A), mặt vỏ bằng phẳng, trên mảnh vỏ có ống xuyên vỏ nối giữa hai mảnh vỏ xuyên qua tế bào (Hình 3.2 B). Các gai có hình trụ tứ giác trên các cạnh có
20µm
gai nhỏ phân bố xoắn theo hình xoắn ốc (Hình 3.2 C). Ngoài ra, bào tử nghỉ của
Chaetoceros sp. có hình elip, một đầu có các tua (Hình 3.2 D). Các kết quả mô tả về
hình thái, các kích thước cơ bản của loài tảo này được thể hiện trong Bảng 3.1.
A B
C D
Hình 3.2. Ảnh SEM tảo Chaetoceros sp.
(A) Hai mảnh vỏ. (B) Mặt vỏ có ống xuyên vỏ. (C) Gai hình trụ tứ giác với các gai trên cạnh. (D) Bào tử nghỉ.
Bảng 3.1. Kết quả mô tả hình dạng của Chaetoceros sp.
Đặc điểm Chaetoceros sp.
Hình dạng chung Tế bào đơn dính thành chuỗi
Hình dạng mặt vỏ Hình bầu dục
Chiều rộng vỏ 5,41 – 5,99 µm
Dựa vào các đặc điểm hình thái quan sát dưới kính hiển vi quang học, ảnh chụp SEM, và so sánh với một số thông tin trong các tài liệu tham khảo về phân loại tảo silic như [2], [14], [37] loài tảo silic được phân lập tại sông Lò Vôi trong nghiên cứu này là thuộc chi Chaetoceros, và có hệ thống phân loại như sau:
Giới: Ngành: Phân ngành: Lớp: Phân lớp: Bộ: Họ: Chi: Protista Bacillariophyta Bacillariophytina Mediophyceae Chaetocerotophycidae Chaetocerotales Chaetocerotaceae Chaetoceros
3.1.2. Kết quả phân tích mã vạch DNA
a. Tách chiết DNA tổng số
Để có thêm những thông tin phân tử phục vụ định danh loài tảo thuộc chi
Chaetoceros đã được phân lập, DNA tổng số của loài tảo này đã được tách chiết và
thực hiện điện di và kiểm tra chất lượng. Mẫu DNA tổng số được bảo quản ở -30 ºC để sử dụng về sau.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy DNA tổng số là một băng sáng rõ, sắc nét và ít bị đứt gãy, không có nhiều smear (Hình 3.3)
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số của Chaetoceros sp.
Kết quả đo OD bằng máy Nanodrop cũng cho thấy mẫu DNA tổng số có độ tinh sạch cao, tỉ số hấp thụ của hai bước sóng 260/280 là 1.8 (Hình 3.4), đủ tiêu chuẩn chất lượng cho việc tiến hành các phản ứng PCR.
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng Nanodrop
b. Khuếch đại các mã vạch rcbL-3P và LSU D2-D3 bằng kĩ thuật PCR.
Dựa vào kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy sản phẩm PCR của vùng gen rbcL-3P (mã vạch DNA sơ cấp) của tảo silic Chaetoceros sp. là một băng DNA sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí ở giữa băng 800 bp và 900 bp (Hình 3.5, băng số 2). Sản phẩm khuếch đại trình tự đoạn gen LSU D2-D3 (mã vạch DNA thứ cấp) là một băng DNA đều sáng đậm, rõ nét, tập trung ở vị trí băng 600 bp và 700 bp (Hình 3.5, băng số 3). Các sản phẩm PCR đều có kích thước phân tử phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến khi thiết kế mồi để khuếch đại. Như vậy, việc khuếch đại trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3 của tảo silic Chaetoceros sp. bằng kĩ thuật PCR đã thực hiện và có thể được sử dụng các sản phẩm PCR này để thực hiện giải trình tự trực tiếp bằng chính các mồi đã dùng để khuếch đại.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR của vùng gen rbcL 3P và LSU D2-D3
(1) Thang DNA 100kb. (2) Vùng gen rbcL- 3P. (3) Vùng gen LSU D2-D3.
c. Phân tích các kết quả giải trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3
Sau khi giải nhận kết quả giải trình tự thô, trình tự mồi sẽ được loại bỏ, loại bỏ thêm các vùng nhiễu do lỗi đọc trình tự nằm ở hai đầu, kết quả cuối cùng thu được về giải trình tự vùng gen rbcL-3P và LSU D2-D3 độ dài lần lượt là 866 bp và 615 bp. Kĩ thuật BLAST được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự truy vấn với các trình tự đã công bố trên cơ sở dữ liệu Genbank.
Kết quả BLAST cho thấy trình tự vùng gen rbcL- 3P chỉ có độ tương đồng
khoảng 75-77% với các trình tham khảo của một số loài thuộc chi Chaetoceros trên Genbank (Hình 3.6), điều này mới chỉ có thể xác định đối tượng tảo silic nghiên cứu thuộc chi Chaetoceros.
Kết quả BLAST trình tự vùng gen LSU D2-D3 của Chaetoceros sp. cho thấy
mức độ tương đồng cao đến 99,55% so với trình tự Chaetoceros subtilis trên cơ sở dữ liệu Genbank (Hình 3.7).
Hình 3.7. Kết quả BLAST trình tự gen LSU D2-D3 trên GenBank
Như vậy chỉ thị mã vạch DNA thứ cấp (LSU D2-D3) đã giúp xác định chính xác hơn về sự tương đồng so với chỉ thị mã vạch DNA thứ cấp (rbcL-3P) ở loài
Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này và thể hiện sự tương đồng cao nhất với loài Chaetoceros subtilis.
d. Xây dựng cây phát sinh chủng loài dựa theo trình tự vùng gen LSU D2-D3
Sử dụng trình tự gen LSU của một số loài tảo thuộc chi Chaetoceros trên
GenBank để thực hiện xây dựng cây phát sinh chủng loài. Các trình tự này có chiều dài đủ theo yêu cầu là 615 bp và độ tương đồng từ 86,69% - 99,55% so với trình tự
Bảng 3.2. Kết quả BLAST vùng gen LSU D2-D3 các mẫu tương đồng trên cơ sở dữ liệu của GenBank
STT Tên loài Mức độ tương đồng di truyền Mã số trình tự trong GenBank 1 Chaetoceros subtilis 99,55% MG786437.1 2 Chaetoceros simplex 96,31% KC986089.1 3 Chaetoceros similis 93,12% KC986088.1 4 Chaetoceros cf. diadema 91,11% KC986070.1 5 Chaetoceros teres 87,16% KC986106.1 6 Chaetoceros didymus 86,69% KC986080.1
Hình 3.8. Mô hình cây phát sinh chủng loài của Chaetoceros sp. dựa vào trình tự vùng gen LSU D2-D3
Từ kết quả cây phát sinh chủng loài được xây dựng dựa trên trình tự vùng gen
LSU D2-D3 đã được thực hiện (Hình 3.8). Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài
cho thấy Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này có quan hệ gần gũi nhất với
Chaetoceros subtilis với độ tin cậy 100% và tạo thành 1 nhóm riêng trong cây phát
sinh loài. (Hình 3.8).
Từ kết quả định danh dựa vào hình thái, phân tích mã vạch DNA bằng kĩ thuật BLAST của hai vùng trình tự gen rbcL-3P và LSU D2-D3, kết quả phân tích phát sinh
chủng loài dựa trên trình tự LSU D2-D3, loài Chaetoceros sp. trong nghiên cứu này được xác định là Chaetoceros subtilis. Những kết quả về phân tích hình thái, xây dựng mã vạch DNA cho loài tảo này đã đóng góp thêm nhiều thông tin, dữ liệu khoa học quan trọng. Sự kết hợp giữa phương pháp định danh truyền thống dựa vào hình thái với phương pháp định danh dựa vào mã vạch DNA đã cho thấy tính hiệu quả cao khi áp dụng để định danh loài tảo thuộc nhóm tảo silic. Các kết quả ban đầu đạt được trong nghiên cứu này có thể hướng tới áp dụng kỹ thuật mã vạch DNA trong nghiên cứu về sự đa dạng loài và ứng dụng của các loài tảo silic phân bố ven biển Việt Nam. Đối tượng tảo C. subtilis đã được quan tâm nghiên cứu về các đặc điểm sinh lí như ảnh hưởng kết hợp giữa N–NO3- và N–NH4+ lên sự tăng trưởng [38], tìm hiểu ảnh hưởng của một số kim loại nặng lên sự tăng trưởng, khảo sát ảnh hưởng của nitrogen và phosphor lên sự tăng trưởng [39], ảnh hưởng của nitrogen–ammonium lên sự sinh trưởng [22]. Tuy nhiên việc nhân nuôi sinh khối để phục vụ nuôi trồng thủy sản cho địa phương Cần Giờ thì chưa được quan tâm nhiều. Nghiên cứu sinh trưởng và thử nghiệm nhân sinh khối liên tục loài C. subtilis là rất cần thiết và có nhiều thách thức lớn, cần tiến hành từ quy mô phòng thí nghiệm đến thực nghiệm ngoài thực tế.
3.2. Sự sinh trưởng của tảo Chaetoceros Subtilis ở quy mô phòng thí nghiệm 3.2.1. Mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD 3.2.1. Mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD
Để xác định mối tương quan giữa mật độ tế bào và mật độ quang, tiến hành đo OD ở bước sóng 680nm và đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Mật độ của tế bào tỉ lệ thuận với độ đục của môi trường hay tỉ lệ với mật độ quang của mẫu đó, mật độ tế bào càng cao thì số OD càng lớn và môi trường càng đục. Kết quả tương quan mật
độ tế bào và OD cho thấy mối quan hệ giữa nồng độ tế bào và độ hấp thụ có mô hình tuyến tính: Mật độ tế bào = 314.04 x Độ hấp phụ - 1.2825 với hệ số xác định của mô hình hồi quy R2 = 0.98 (hình 3.9). Công thức này được sử dụng để xác định mật độ tế bào về sau nhằm tiết kiệm thời gian những vẫn đảm bảo sự chính xác.
Hình 3.9. Mối tương quan giữa mật độ tế bào và mật độ quang 3.2.2. Sự sinh trưởng của C.subtilis trong các loại môi trường nuôi cấy khác nhau
Để xác định môi trường tối ưu cho sinh khối cao nhất và môi trường dinh dưỡng dễ pha, dễ tìm để có thể ứng dụng vào thực tế, thí nghiệm được tiến hành với 3 loại môi trường khác nhau là đối chứng nước biển tự nhiên, F/2 và môi trường nước biển tự nhiên được xử lí bổ sung phân bón NPK với các hàm lượng khác nhau là 1mg/l, 1,25mg/l, 2mg/l, 5mg/l, 10mg/l, 15mg/l, 20mg/l; mật độ ban đầu là 5x104 tb/ml. y = 314.04x - 1.2825 R² = 0.9842 0 2 4 6 8 10 12 14 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Mậ t độ tế bà o (x 10 4 tb/ml) OD680nm
Hình 3.10. Đường cong tăng trưởng của Chaetoceros sp. ở các môi trường khác nhau
Kết quả phân tích cho thấy có sự khác nhau về mật độ số tảo ở các môi trường nuôi trong suốt quá trình thí nghiệm. Sau 24 giờ nuôi cấy, tảo nhân mật số rất nhanh, tuỳ theo điều kiện môi trường dinh dưỡng khác nhau mà thời gian suy tàn sẽ khác nhau (Hình 3.10). Nhìn chung, sự phát triển của tảo chia làm hai giai đoạn chính: giai đoạn tăng trưởng và giai đoạn suy tàn. Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy có sự khác nhau về mật độ tảo giữa các môi trường nuôi tảo.
Ở tất các các môi trường đều trải qua pha cảm ứng khoảng 1 ngày sau cấy chuyền, sau đó các tế bào vào pha tăng trưởng mạnh với sự gia tăng mật độ tế bào theo thời gian (Bảng 3.3).
Sự suy vong của tảo silic Chaetoceros subtilis bắt đầu sớm ở môi trường đối
chứng, quần thể đạt mật độ cực đại ngay ngày thứ 2 sau cấy chuyền là 11,22± 0,65 x104 tb/ml, sau đó mật độ quần thể giảm nhanh chóng ở ngày thứ 3 là 8,05d ± 0,51 tb/ml đạt trạng thái tăng trưởng mạnh nhất từ ngày thứ 3 đến thứ 4. Sau đó quần thể