tR (phút) H
H
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của methanol trong pha động.
%Methanol Paracetamol Caffein Thơi gian lưu(tR - phút) Diện tíchpic (S) Thời gian lưu(tR – phút) Diện tíchpic (S) 100 2,14 16561,13 2,52 61705,82 90 2,08 21742,12 2,45 46255,60
Nhìn vảo bảng 3.1 và pic sắc kí trong hình 3.1 nhận thấy với tỷ lệ CH3OH 100% hai chất đầu tách rõ ràng, pic sắc nét và thời gian rửa giải ra nhanh hơn. Tiến hành chạy sắc kí kiểm tra với hỗn hợp hai chất cần phân tích theo chương trình sau :
- Cột tách: RP – 18, 5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
- Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm cho mỗi chất. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
-Detector: 270 nm
Kết quả thu được sắc kí đồ sau :
Hình 3.2. Sắc kí đồ hỗn hợp paracetamol và caffein với pha động là methanol
paracetamol
Do đó lựa chọn tỉ lệ pha động 100% CH3OH để tiến hành phân tích đồng thời hai chất.
3.1.2.Khảo sát tốc độ pha động
Sự ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu và chiều cao pic sắc kí được khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp paracetamol và caffein với các tốc độ khác nhau:
• 0,8 ml/phút. • 1ml/phút. • 1,2ml /phút. • 1,4 ml/phút.
Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20µl. - Nồng độ chất phân tích: • Paracetamol: 2,4 ppm • Caffein: 2,4 ppm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector UV-VIS: 270 nm.
- Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4.
Bảng 3.2.Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và chiều cao đĩa lý thuyết.
Tốc độ pha động u (ml / phút)
Paracetamol Caffein
Thời gian lưu (tR – phút)
Chiều cao đĩa lý thuyết (H)
Thời gian lưu (tR - phút)
Chiều cao đĩa lý thuyết (H) 0,8 2,654 12416,71 3,118 25426,13 1,0 2,080 10550,11 2,451 17402,01 1,2 1,729 7461,28 2,036 12702,78 1,4 1,505 8030,38 1,770 15594,63 a) b)
Hình 3.3. Sự phụ thuộc của chiều cao đĩa lý thuyết vào tốc độ pha động
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0.5 1 1.5
Theo đường cong Van Deemter, giá trị tốc độ tối ưu để hiệu quả tách là lớn nhất là 1,2 ml/phút.
Như vậy từ các khảo sát ở trên ta rút ra được điều kiện chạy tối ưu để phân tích đồng thời paracetamol và caffein như sau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl.
3.2. Phân tích mẫu dược phẩm 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của paracetamol được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn paracetamol có nồng độ tăng dần sau: 6 ppm, 12 ppm, 24 ppm, 48 ppm, 96 ppm, 192 ppm, 240 ppm. Tiến hành pha dãy chuẩn như sau:
- Pha loãng dung dịch paracetamol gốc có nồng độ 1200 ppm thành 100 ml dung dịch paracetamol có nồng độ 240 ppm: hút chính xác 20 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100 ml, định mức bằng methanol cho đến vạch.
- Pha dãy chuẩn từ dung dịch 240 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng methanol. Cụ thể như sau:
C (ppm) 6 12 24 48 96 192 240
Vx (ml) 0,25 0,5 1 2 4 8 10
Vmethanol Định mức đến vạch
Để khảo sát khoảng tuyến tính của caffein, ta cũng tiến hành khảo sát dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần: 2,4 ppm; 6 ppm; 12 ppm; 24 ppm; 48ppm; 96 ppm và
caffein có nồng độ 240 ppm (dung dịch này cũng được pha loãng từ dung dịch caffein gốc có nồng độ 1200 ppm) cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng dung dịch methanol.
C (ppm) 2,4 6 12 24 48 96 192
Vx (ml) 0,1 0,25 0,5 1 2 4 8
Vmethanol Định mức đến vạch
Sau đó, tiến hành chạy sắc kí với từng dung dịch của mỗi dãy chuẩn theo chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250 C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl.
Từ các giá trị diện tích pic Sp thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic Sp và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn.
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng 3.3, bảng 3.4, hình 3.4 và hình 3.5.
Bảng 3.3.Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc kí vào nồng độ của paracetamol. Nồng độ C (ppm) Diện tích pic Sp 6 43910,90 12 108529,73 24 263325,01 48 327274,36 96 633312,42 192 2271446,69 240 2906672,58
Hình 3.4. Đường chuẩn của paracetamol.
Từ các số liệu thực nghiệm, ta thu được kết quả sau: Khoảng tuyến tính của paracetamol là 6 – 240 ppm.
Mối quan hệ giữa diện tích pic (y) với nồng độ của paracetamol (x) được thể hiện qua phương trình: y = 12323. x – 85277 (3.1) Hệ số tương quan r = 0,997. y = 12323x - 85277 R² = 0.9948 -500000 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 200 250 300
Bảng 3.4 Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của caffein. Nồng độ C Diện tích pic Sp 2,4 29134,10 6 73917,45 12 253571,96 24 459172,79 48 890985,14 96 1697188,25 192 2932110,53
Hình 3.5. Đường chuẩn của caffein.
Từ các số liệu thực nghiệm, ta thu được kết quả sau: Khoảng tuyến tính của caffein là 2,4 – 192 ppm.
Mối quan hệ giữa diện tích pic (y) với nồng độ của paracetamol (x) được thể hiện qua phương trình: y = 15415. x + 67467 (3.2) Hệ số tương quan r = 0,996. y = 15415x + 67467 R² = 0.9924 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 200 250
3.2.2.Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm 3.2.2.1. Xử lý mẫu 3.2.2.1. Xử lý mẫu
Tiến hành khảo sát quy trình chiết mẫu đã trình bày ở mục 2.2.2.2, cụ thể như sau:
- Nghiền mịn 10 viên thuốc Panadol Extra (m = 6,875 g) bằng chén sứ, chày sứ. - Cân một lượng tương đương với khối lượng 2 viên thuốc (1,375 g), lắc với pha động bằng máy lắc KS130 Basic trong 15 phút, tốc độ lắc 240 vòng/phút. Sau đó lọc lấy phần dung dịch.
- Chạy sắc kí phần dung dịch thu được ở lần lọc thứ hai. Kết quả thu được pic trên sắc kí đồ. Như vậy, chất cần phân tích vẫn chưa được chiết hoàn toàn.
- Tiến hành lặp lạiquá trình lắc, lọc mẫu và chạy sắc kí. Kết quả thu được cho thấy diện tích pic giảm dần sau mỗi lần lọc mẫu. Đến lần thứ 6 thì không thu được pic trên sắc kí đồ nữa. Vì thế, có thể kết luận chất cần phân tích đã được chiết hoàn toàn sau 5 lần lọc.
- Thu phần dung dịch trong 5 lần lọc đầu cho vào bình định mức 250 ml, định mức đến vạch bằng methanol. Dung dịch này được giữ lại dùng cho việc phân tích hàm lượng chất có trong mẫu thuốc Panadol Extra ở mục 3.2.2.2, kí hiệu là PE1.
Kết quả xử lí mẫu (viên nén Panadol Extra) được chỉ ra trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Diện tích pic thu được sau mỗi lần lọc.
Lần lọc Diện tích pic paracetamol caffein 2 2880962,83 677185,42 3 759619,68 171843,16 4 341910,87 74303,69 5 273094,01 64054,84
3.2.2.2. Phân tích định lượng mẫu dược phẩm
Hàm lượng paracetamol và caffein có trong mẫu thuốc Panadol Extra được xác định như sau:
- Dùng pipet hút chính xác 0,5 ml dung dịch mẫu PE1 cho vào bình định mức 10 ml, định mức bằng methanol đến vạch.
- Tiến hành chạy sắc kí với dung dịch mẫu đã pha loãng ở trên, ghi lại kết quả thu được.
- Nồng độ paracetamol và caffein được tính từ phương trình (3.1) và (3.2). - Tiến hành lặp lại tương tự như trên đối với các mẫu PE2 và PE3.
Kết quả phân tích mẫu dược phẩm được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.6, Bảng 3.6. Kết quả phân tích các mẫu dược phẩm.
Mẫu Sparacetamol Scaffein Cparacetamol
(ppm) Ccaffein (ppm) PE1 1907923,63 428688,63 162,56 23,43 PE2 1981550,56 419057,54 167,72 22,81 PE3 2114343,02 446152,09 178,50 24,57 C� (ppm) 170 ± 25 23,60 ± 2,7
H H tR tR H tR a) b ) c) Hình 3.6. Sắc kí đồ của các mẫu thuốc a) Mẫu PE1 b) Mẫu PE2 c) Mẫu PE3
Từ nồng độ paracetamol và caffein có trong mẫu, ta quy đổi sang hàm lượng của chúng trong 2 viên thuốc Panadol Extra như sau:
𝑚 =𝐶 .𝑉 .𝐹 . 10−3 Trong đó:
- m: khối lượng chất phân tích có trong 2 viên thuốc (mg)
- C: nồng độ chất phân tích tính theo phương trình hồi quy (ppm). - V: thể tích của dung dịch mẫu (ml)
- F: hệ số pha loãng.
Từ kết quả thu được tính khả năng thu hồi theo công thức:
𝐻 = 𝑚𝑚𝐻𝑄 𝑇𝑇
Trong đó: mHQ và mTT lần lượt là khối lượng chất tính theo phương trình hồi quy và khối lượng chất trên thực tế.
Kết quả phân tích hàm lượng của paracetamol và caffein trong 2 viên thuốc Panadol Extra được trình bày trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng paracetamol và caffein trong 2 viên thuốc Panadol Extra.
Paracetamol Caffein
m (mg) 850 ± 125 118 ± 13,5
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1. Kết luận
Kết quả đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC” cho những kết luận sau:
1. Chọn được điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng hệ thống sắc kí HPLC sử dụng detector UV-VIS. - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl.
2. Xác định được khoảng tuyến tính cho hai chất paracetamol và caffein
Paracetamol Caffein
Phương trình hồi quy y = 12323. x – 85277 y = 15415. x + 67467
Hệ số tương quan r = 0,997 r = 0,996
Khoảng tuyến tính 6 – 240 ppm 2,4 – 192 ppm
3. Phân tích hàm lượng paracetamol và caffein trong mẫu dược phẩm Panadol Extra thu được hệ số thu hồi đối với paracetamol là 0,85 ± 0,125 và đối với caffein là 0,908 ± 0,135.
4.2. Đề nghị
Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy phương pháp xác định đồng thời paracetamol và caffein tương đối tốt và có thể sử dụng để xác định hàm lượng paracetamol và caffein trong dược phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết sắc kí lỏng iệu năng cao HPLC, trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.
[2]. Hồ Viết Quý, Phân tích lí – hóa, NXB. Giáo dục. [3]. Bộ Y tế, Dược thư quốc gia, NXB. Y học, 2009. [4]. Bộ Y tế, Dược điển quốc gia, NXB. Y học, 2010.
[5]. Sinan Suzen, Cemal Akay, Senol Tartilmis, R. Serdar Erdol, Atilla Onal and Semsettin Cevheroglu (1998), Quantitative of acetaminophen in pharmaceutical formulations using high-performance liquid chromatography, J. Fac. Pharm. Ankara,
pp. 93-100.
[6]. Shulin Zhao, Wenling Bai, Hongyan Yuan and Dan Xiao (2006), Detection
of paracetamol by capillary electrophoresiswith chemiluminescence detection,
Analytica Chimica Acta,pp. 195-199.
[7]. Wenrui Jin, Daiqing Yu, Qian Dong, and Xiaoying Ye (2000), Quantitation
of Caffeine by Capillary ZoneElectrophoresis with End-Column AmperometricDetection at a Carbon Microdisk Array Electrode, Journal of
Chromatographic Science, Vol. 38, pp. 11-15.
[8]. Guzin Alpdogan, Kadir Karabina and Sidika Sungurg (2000),
DerivativeSpectrophotometric Determination ofCaffeine in Some Beverages, Turk J
Chem, 2002, pp. 295-302.
[9]. H. Tavallali and M. Sheikhaei (2009), Simultaneous kinetic determination of paracetamol and caffeine by H-point standard addition method, African Journal of
Pure and Applied Chemistry Vol. 3, pp. 11-19.
[10]. Vijaya Vichare, Preeti Mujgond, Vrushali Tambe and Dhole S.N (2010),Simultaneous Spectrophotometric determination of Paracetamol and Caffeine
in tablet formulation, International Journal of PharmTech Research, Vol.2, No.4, pp.
[11]. M. Prodan, E. Gere-Paszti, O. Farkas, E. Forgacs, Validation and
Simultaneous Determination of Paracetamol and Caffeine in Pharmaceutical Formulations by RP-HPLC, Chem. Anal (Warsaw), 2003.
[12]. M. Levent Altun (2001), HPLC Method for the Analysis of Paracetamol,Caeine and Dipyrone, Turk J Chem, pp. 521 – 528.
[13]. Viswanath Reddy Pyreddy, Useni Reddy Mallu, Varaprasad Bobbarala and Somasekhar Penumajji (2011), A novel RP-HPLC method for analysis of paracetamol, pseudoephedrine, caffeine and chlorpheniramine maleate in pharmaceutical dosage forms,Journal of Pharmacy Research 2011, Vol. 4, Issue. 4, pp.
1225-1227.
[14]. SM Ashraful Islam , Shamima Shultana, Muhammad Shahdaat Bin Sayeed and Irin Dewan (2012),UV- spectrophotometric and RP-HPLC methods for
the simultanios estimation of acetaminophen an caffeine: valiation, comparison and application for marketed tablet analysic, International journal of pharmacy, 2012.
[15]. Thái Duy Thìn (2005), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV-VIS để định tính và định lượng các hoạt chất có trong một số thuốc có từ 2 đến 5 thành phần, Bộ Y Tế.
PHỤ LỤC
Phụ lục 2: Sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính của paracetamol.
Phụ lục 3: Sắc kí đồ của các dung dịch chuẩn trong khoảng tuyến tính của caffein.