CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
2.2.1.1.Chọn thể tích vòng mẫu
Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần làm chân pic sắc kí bị doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.
Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng nữa và lúc đó pic sắc kí sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl trong đó vòng mẫu 20 µl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài nghiên cứu này để phân tích đồng thời paracetamol và caffein chúng tôi lựa chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20 µl.
2.2.1.2. Chọn cột
Trong đề tài nghiên cứu này, paracetamol và caffein là những chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc kípha đảo C8 và C18. Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm và được trang bị cho hệ thống HPLC của phòng thí nghiệm của trường, cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu ngắn và được nhà sản xuất hỗ trợ về kỹ thuật nên chúng tôi chọn cột Brownlee RP – 18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng này.
2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220x4,6 mm. -Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
-Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
2.2.1.4. Khảo sát tốc độ pha động
Để khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động, tiến hành khảo sát sự thay đổi chiều cao pic sắc kí theo bước sóng của detector với điều kiện chạy sắc kí:
-Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm.
-Thể tích vòng mẫu: 20µl.
-Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
-Detector: UV-VIS.
-Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4.
Tổng kết các điều kiện đã khảo sát suy ra điều kiện tối ưu để phân tách đồng thời paracetamol và caffein.