H. Tavallali và M. Sheikhaei đã tiến hành xác định đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp thêm chuẩn điểm H vào năm 2009. Phương pháp dựa trên sự khác nhau về tỉ lệ oxi hóa của hai chất cần xác định với Cu(II) neocuproine và sự tạo thành phức Cu(I) neocuproine tại bước sóng quang phổ là 453 nm và điều kiện pH là 5,0 với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt natri dodecyl sunfat. Paracetamol được xác định trong khoảng nồng độ 1,5 – 7,0 µg/ml và caffein được xác định trong khoảng nồng độ 0,1 – 3,0 µg/ml [9].
Năm 2010, Vijaya Vichare, Preeti Mujgond và cộng sự sử dụng phương pháp trắc quang để xác định đồng thời paracetamol và caffein trong các sản phẩm dược. Khoảng tuyến tính thu được nằm trong khoảng 2 – 16 µg/ml đối với paracetamol và 2 – 32 µg/ml đối với caffein [10].
Paracetamol và caffein trong thuốc đã được M. Prodan và cộng sự xác định bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18, dung môi pha động là methanol : nước
theo tỉ lệ thể tích 40:60, tốc độ pha động là 0,5 ml/phút. Bước sóng của đầu dò với mỗi chất là 249 nm và 279 nm [11].
M. Levent Altun dùng phương pháp HPLC phân tích đồng thời paracetamol, caffein và dipyrone, sử dụng cột C8 với tốc độ pha động là 1 ml/phút. Hệ dung môi pha động được sử dụng gồm 0,01 M KH2PO4,methanol, acetonitrile, isopropyl alcohol với tỉ lệ thể tích 420:20:30:30 và bước sóng của đầu dò tại 215 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính của paracetamol, caffein và dipyrone lần lượt là 0,409 – 400 µg/ml, 0,151 – 200 µg/ml and 0,233 – 600 µg/ml [12].
Viswanath Reddy Pyreddy cùng cộng sự xác định đồng thời paracetamol, caffein, pseudoephedrine và chlorpheniramine maleate trong dược phẩm bằng phương pháp HPLC vào năm 2011.Chương trình sắc kí sử dụng cột C18 (150mm, 4.6mm và 3µm) với chương trình gradient nồng độ. Hệ dung môi pha động gồm dung dịch A là đệm phosphate (1,0g KH2PO4 trong 1000 ml nước) và dung dịch B là acetonitrile với tốc độ pha động là 1 ml/phút ở 400C tại bước sóng 210 nm và chương trình chạy sắc kí sau:
Thời gian
(phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 17 17 - 20 20 - 25 %VddA 94-94 94-86 86-54 54-52 52 – 94 94 – 94
Kết quả thu được pic sắc kí của paracetamol, pseudoephedrine HCl, caffein và chlorpheniramine maleate theo thứ tự tại phút thứ 6,5; 9,7; 12,0 và 16,2. Khoảng nồng độ tuyến tính thu được của mỗi chất trong khoảng từ 10-60 µg/ml với hệ số tương quan r = 0,999 và hệ số thu hồi đạt 98 – 102% [13].
SM Ashraful Islam , Shamima Shultana, Muhammad Shahdaat Bin Sayeed và Irin Dewan xác định đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp trắc quang và HPLC sử dụng cột C18 với dung môi pha động là đệm photphat (pH= 5,5) và methanol theo tỉ lệ thể tích là 60:40, tốc độ pha động là 1ml/phút tại bước sóng 273 nm. Khả năng thu hồi đạt 99,29 – 100,19% khi phân tích bằng phương pháp trắc quang
Thái Duy Thìn đã sử dụng phương pháp HPLC với chương trinh sắc kí sử dụng cột C18 (250 x 4 mm, 10 µm), pha động là dung dịch axit photphoric 0,75% trong hỗn hợp dung môi methanol : nước (35 : 65), tốc độ dòng 1ml/phút. Kết quả thu được thời gian lưu của paracetamol và caffein lần lượt là 2,219 và 6,041. Độ lặp lại của phương pháp tốt với sai số tương đối nằm trong khoảng 0,54 – 1,07% [15]
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất, dụng cụ
2.1.1. Hoá chất 2.1.1.1. Chất chuẩn 2.1.1.1. Chất chuẩn
STT Tên chất chuẩn Số lộ hiện hành Số lô thay thế Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Paracetamol QT009 121911 QT009 130312 99,87%
2 Caffein QT028080411 QT028100313 99,70%
Dung dịch gốc 1200 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong metanol tinh khiết loại dùng cho HPLC, được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch làm việc được pha từ dung dịch gốc bằng methanol. Các dung dịch loãng chỉ sử dụng trong ngày.
2.1.1.2. Dung môi
STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Acetonitril Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC ≥ 99,80 %
2 Methanol Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC ≥ 99,80 %
3 Water Merk KGaA
Đức
Dùng cho
HPLC ≥ 99,80 %
2.1.1.3. Chất chuẩn khác
STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Chlorofom Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 % 2 Acid Phosphoric Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 85,00 %
3 NaOH Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC ≥ 99,80 %
2.1.2.Dụng cụ, thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị
STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số
1 Bình dựng dung
môi 4 kênh Pyrex 1000 ml Germany 00330341
2 Bơm cao áp Pump Perkin Elmer Series 200
3 Bộ loại khí cho
dung môi Vacuum Degasser Perkin Elmer Series 200
4 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100 𝜇𝑙 Hamilton 80665
5 Thiết bị nạp mẫu Injector 20 𝜇𝑙 USA 6 Cột sắc kí Brownlee Columns
RP - 18
Perkin Elmer
Brownlee Columns 07110017 7 Thiết bị ghi tín
hiệu UV/Vis Detector Perkin Elmer Series 200
8 Thiết bị nhận tín hiệu và phần mềm điều khiển hệ thống Bộ PC cài đặt phần mềm Total Chrom Workstation ver6.1.3 Intel Phần mềm do Perkin Elmer cung cấp 9 Bộ lọc dung môi cho giấy lọc 0,45𝜇𝑚 Glassico India 10 Máy rút chân
không Neuburger KNF-Germany N035AN.18
11 Giấy lọc 0,45𝜇𝑚 Membrane Filter
Sterile Whatman, Japan 7141104
12 Máy lắc KS130 Basic IKA - Germany KS130B
13 Máy đánh siêu
14 Cân phân tích Balances and
Precious Metal scales Sartorius 98648-012-13 15 Máy đo quang Lambda 25 UV/Vis
Spectrometor Perkin Elmer 101N7062504 16 Máy lọc nước
siêu sạch Water Pro PS LABCONCO 091118524
2.1.2.2. Dụng cụ
- Bình định mức các loại. - Pipet các loại.
- Bình tam giác, cốc thủy tinh.
- Ống nhỏ giọt, bình tia, phễu busne, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường, giấy parafin.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu 2.2.1.1.Chọn thể tích vòng mẫu 2.2.1.1.Chọn thể tích vòng mẫu
Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột.Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần làm chân pic sắc kí bị doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách.
Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc kí cũng không tăng nữa và lúc đó pic sắc kí sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 50 và 100 µl trong đó vòng mẫu 20 µl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài nghiên cứu này để phân tích đồng thời paracetamol và caffein chúng tôi lựa chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20 µl.
2.2.1.2. Chọn cột
Trong đề tài nghiên cứu này, paracetamol và caffein là những chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc kípha đảo C8 và C18. Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm và được trang bị cho hệ thống HPLC của phòng thí nghiệm của trường, cho thấy khả năng tách tốt, thời gian lưu ngắn và được nhà sản xuất hỗ trợ về kỹ thuật nên chúng tôi chọn cột Brownlee RP – 18,5µm, 220 x 4,6mm cho phép định lượng này.
2.2.1.3. Khảo sát thành phần pha động
Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220x4,6 mm. -Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
-Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
2.2.1.4. Khảo sát tốc độ pha động
Để khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động, tiến hành khảo sát sự thay đổi chiều cao pic sắc kí theo bước sóng của detector với điều kiện chạy sắc kí:
-Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm.
-Thể tích vòng mẫu: 20µl.
-Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm. -Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
-Detector: UV-VIS.
-Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4.
Tổng kết các điều kiện đã khảo sát suy ra điều kiện tối ưu để phân tách đồng thời paracetamol và caffein.
2.2.2. Phân tích mẫu dược phẩm 2.2.2.1. Xác định khoảng tuyến tính 2.2.2.1. Xác định khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.
Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của paracetamol, caffein và diện tích pic sắc kí, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần trong dung môi pha động. Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.2.1, ghi giá trị diện tích pic và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng phương trình hồi quy mối quan hệ giữa nồng độ C và diện tích pic Spic.
2.2.2.2. Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm a) Xử lý mẫu
Do mẫu thuốc khảo sát ở dạng viên nén nên chúng tôi đã tiến hành khảo sát quy trình chiết mẫu như sau:
- Cân 10 viên mẫu thuốc, ghi lại kết quả cân.
- Nghiền mịn mẫu bằng chén sứ sau đó cân một lượng mẫu và ghi lại kết quả (m g).
- Cho m (g) mẫu vào bình bình tam giác có chứa 30 ml dung dịch pha động. Lắc trong 15 phút. Sau đó lọc tách phần cặn không tan và phần dung dịch. - Chạy sắc kí phần dung dịch thu được sau lần lọc thứ hai.
• Nếu không có pic xuất hiện trên sắc kí đồ có nghĩa là lượng chất cần phân tích đã được chiết hoàn toàn trong lần lọc đầu tiên.
• Ngược lại có nghĩa là lượng chất cần phân tích vẫn chưa được chiết hoàn toàn. Khi đó, tiến hành lặp lại quá trình lắc và lọc mẫu n lần cho đến khi không có pic xuất hiện trên sắc kí đồ. Như vậy, lượng chất trong mẫu đã được chiết hoàn toàn trong (n – 1) lần lọc. Có thể khái quát quy trình theo sơ đồ sau:
b) Phân tích định lượng mẫu dược phẩm
Mẫu thuốc khảo sát được sử dụng là thuốc giảm đau và hạ sốt Panadol Extra do Công ty liên doanh Dược phẩm Sanobe Synthelabo Việt Nam sản xuất với số đăng kí VNB – 0891 – 03. Mỗi viên Panadol Extra chứa 500 mg paracetamol và 65 mg caffein.
Áp dụng quy trình chiết mẫu ở mục 2.2.3.1, tiến hành chiết mẫu lấy phần dung dịch có chứa chất cần phân tích đối với mẫu thuốc, pha loãng dung dịch bằng dung môi pha động sao cho nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Tiến hành chạy sắc kí với điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 2.2.1. Lặp lại ít nhất ba lần.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu
3.1.1.Khảo sát thành phần pha động
Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục 2.2.1.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn của paracetamol được pha loãng từ dung dịch gốc 1200 ppm. Thành phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là methanol và nước với các tỉ lệ thể tích khác nhau.
Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào thành phần pha động được chỉ ra trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc kí đồ của paracetamol và caffein khi khảo sát pha động. a) Paracetamol – 100% CH3OH. b) Paracetamol – 90% CH3OH.
tR (phút) H
H
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của methanol trong pha động.
%Methanol Paracetamol Caffein Thơi gian lưu(tR - phút) Diện tíchpic (S) Thời gian lưu(tR – phút) Diện tíchpic (S) 100 2,14 16561,13 2,52 61705,82 90 2,08 21742,12 2,45 46255,60
Nhìn vảo bảng 3.1 và pic sắc kí trong hình 3.1 nhận thấy với tỷ lệ CH3OH 100% hai chất đầu tách rõ ràng, pic sắc nét và thời gian rửa giải ra nhanh hơn. Tiến hành chạy sắc kí kiểm tra với hỗn hợp hai chất cần phân tích theo chương trình sau :
- Cột tách: RP – 18, 5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl.
- Nồng độ chất phân tích: 2,4 ppm cho mỗi chất. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
-Detector: 270 nm
Kết quả thu được sắc kí đồ sau :
Hình 3.2. Sắc kí đồ hỗn hợp paracetamol và caffein với pha động là methanol
paracetamol
Do đó lựa chọn tỉ lệ pha động 100% CH3OH để tiến hành phân tích đồng thời hai chất.
3.1.2.Khảo sát tốc độ pha động
Sự ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu và chiều cao pic sắc kí được khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp paracetamol và caffein với các tốc độ khác nhau:
• 0,8 ml/phút. • 1ml/phút. • 1,2ml /phút. • 1,4 ml/phút.
Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau: - Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20µl. - Nồng độ chất phân tích: • Paracetamol: 2,4 ppm • Caffein: 2,4 ppm - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector UV-VIS: 270 nm.
- Pha động: pha động đã khảo sát ở 2.2.1.4.
Bảng 3.2.Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và chiều cao đĩa lý thuyết.
Tốc độ pha động u (ml / phút)
Paracetamol Caffein
Thời gian lưu (tR – phút)
Chiều cao đĩa lý thuyết (H)
Thời gian lưu (tR - phút)
Chiều cao đĩa lý thuyết (H) 0,8 2,654 12416,71 3,118 25426,13 1,0 2,080 10550,11 2,451 17402,01 1,2 1,729 7461,28 2,036 12702,78 1,4 1,505 8030,38 1,770 15594,63 a) b)
Hình 3.3. Sự phụ thuộc của chiều cao đĩa lý thuyết vào tốc độ pha động
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 0.5 1 1.5
Theo đường cong Van Deemter, giá trị tốc độ tối ưu để hiệu quả tách là lớn nhất là 1,2 ml/phút.
Như vậy từ các khảo sát ở trên ta rút ra được điều kiện chạy tối ưu để phân tích đồng thời paracetamol và caffein như sau:
- Cột tách: RP – 18,5µm, 220 x 4,6 mm - Pha động : 100% CH3OH - Tốc độ pha động: 1,2 ml/phút. - Detectơ UV-VIS: λ = 270 nm. - Nhiệt độ cột: 250C. - Thể tích vòng mẫu : 20µl.