+ Hệ thống sắc ký khí khối phổ Agilent 7890A GC System và 7000 GC/MS Triple Quad
+ Máy đo pH Meter 744, giá trị đọc ± 0,01, khoảng đo pH = 0,00 – 14,00 + Cân phân tích Precisa XT220A, d=0,001, max: 220 g
+ Ngoài ra còn các thiết bị và dụng cụ trong phòng thí nghiệm như: Bể siêu âm, máy li tâm, máy lắc xoáy, máy cất nước 2 lần, máy lọc nước siêu sạch, các loại bình định mức thủy tinh, ống nghiệm có nắp, pipet, micropipet, cốc thủy tinh, ống đong, phễu, giấy lọc…
26 2.2. ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH
- Chất phân tích: 04 mẫu viên nén nhóm ma túy cathinone sau: Mephedrone, Alpha-PVP, N-ethylpentylone và MDPV.
- Mẫu nghiên cứu:
+ Mẫu trắng: Là mẫu chỉ chứa các thành phần của tá dược (không có hoạt chất cathinone) gồm: tinh bột, magie stearat, bột talc,...
+ Mẫu trắng thêm chuẩn: Là mẫu trắng được thêm chính xác một lượng chất chuẩn cathinone.
+ Mẫu chuẩn: Là mẫu có nồng độ chính xác được pha từ các chất chuẩn. + Mẫu thực tế: Là mẫu viên nén thu trong một số vụ án đã xuất hiện ở Việt Nam.
2.3. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU VÀ XỬ LÝ MẪU
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Các viên nén thu giữ trong các vụ án được phân tích theo mẫu (các mẫu được phân biệt theo đối tượng, vị trí thu giữ, ... tiến hành theo quy trình thu lượm dấu vết ma túy chung). Số lượng mẫu viên nén được lấy theo quy trình như hướng dẫn của “Hướng dẫn lấy mẫu đại diện” của UNODC [25]. Ở mỗi mẫu được phân nhóm dựa theo kết quả nhận dạng cảm quan: màu sắc, kích thước, logo, ....
+ Nếu nhóm có số viên n ≤ 3 thì thu tất cả.
+ Nếu nhóm có số viên n ≥ 4 thì số lượng thu là +1, bằng cách lấy ngẫu nhiên trong nhóm (với n là tổng số viên trong nhóm). Các mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ thủy tinh nút mài khi chờ phân tích.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
Tuỳ theo nội dung phân tích mà lựa chọn phương pháp xử lý mẫu cho phù hợp. Bao gồm:
- Lấy viên nghiền thành bột và trộn đều, dùng làm mẫu thử,
n
27
- Từ bột viên hòa tan trực tiếp vào các dung môi pha mẫu,
- Từ bột viên tiến hành tách chiết và tinh khiết mẫu trước khi phân tích. Có nhiều phương pháp để tách chiết các hoạt chất ra khỏi mẫu viên nén như: chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn, vi chiết siêu pha rắn,... mỗi phương pháp có các ưu nhược điểm khác nhau. Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm giám định các chất ma tuý là chiết lỏng – lỏng.
2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Origin 6.0, Microsoft Office Excel để xử lý kết quả với các đại lượng đặc trưng thống kê mô tả cơ bản sau:
- Giá trị trung bình: = = - Tính độ lệch chuẩn:
- Độ lệch chuẩn gộp (với hai tập số liệu):
- Tính giá trị tthực nghiệm khi so sánh hai giá trị trung bình:
- Tính độ lệch chuẩn tương đối:!"#% = &'% = !"
#$ × 100
- Độ sai chuẩn:
- Tính khoảng tin cậy của kết quả phân tích:
t là chuẩn student, tra trong bảng có sẵn với bậc tự do là (n-2) ở mức độ tin cậy 95% hoặc 99%,…
X n x x x1 + 2 +...+ n n x n i i å =1 å = - - = n 1 i 2 i X) (x 1) (n 1 SD 2 ) ( ) ( 1 ¹ 2 1 2 2 2 - + - + - = + = å å = = B A n B Bi n i A Ai B B A A pooled n n X x X x n S n S S B A B A B A pooled B A thucnghiem n n n n S X X t + - = . ( ) ( 1) 2 1 2 - - = = = å = n n X x n SD n SD SE n i i n SD t X ± . download by : skknchat@gmail.com
28
2.3.3. Một số quy định xác nhận giá trị sử dụng đối với các phương pháp phân tích pháp phân tích
Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là yêu cầu bắt buộc đối với các phương pháp phân tích. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Các quy định về độ thu hồi, độ lặp lại được thực hiện theo Hiệp hội các nhà Hoá phân tích chính thức (Association of Official Analytical Chemists) – AOAC [26]. Quy định về điểm nhận dạng – Identification Point (IP) được áp dụng theo Quyết định của Hội đồng châu Âu về “Xác nhận giá trị của các phương pháp phân tích biên dịch kết quả” để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất dựa trên phổ khối lượng [27].
2.3.3.1. Quy định về độ thu hồi
STT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)
1 100 1 100% 98 – 102 2 ≥ 10 10-1 10% 98 – 102 3 ≥ 1 10-2 1% 97 – 103 4 0,1 10-3 0,1% 95 – 105 5 0,01 10-4 100 mg/L 90 – 107 6 0,001 10-5 10 mg/L 80 – 110 7 0,0001 10-6 1 mg/L 80 – 110 8 0,00001 10-7 100 ppb 80 – 110 9 0,000001 10-8 10 ppb 60 – 115 10 0,0000001 10-9 1 ppb 40 – 120 download by : skknchat@gmail.com
29 2.3.3.2. Quy định về độ lặp lại STT Hàm lượng % Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) 1 100 1 100% 1,3 2 10 10-1 10% 1,8 3 1 10-2 1% 2,7 4 0,1 10-3 0,1% 3,7 5 0,01 10-4 100 mg/L 5,3 6 0,001 10-5 10 mg/L 7,3 7 0,0001 10-6 1 mg/L 11 8 0,00001 10-7 100 ppb 15 9 0,000001 10-8 10 ppb 21 10 0,0000001 10-9 1 ppb 30 2.3.3.3. Quy định về điểm nhận dạng IP
Kỹ thuật Số ion Số điểm IP
GCMS (EI hoặc CI) N N
GCMS (EI và CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GCMS (EI hoặc CI) 2 (dc A) + 2 (dc B) 4
LCMS N N
GC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
LC-MS-MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4
30
GC-MS-MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5 LC-MS –MS 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con 5 LC-MS-MS-MS 1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu 5,5
HRMS N 2n
GC-MS và LC-MS 2 + 2 4
GC-MS và HRMS 2 + 1 4
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU
2.4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích tối ưu của cathinone tổng hợp
2.4.1.1. Điều kiện phân tích trên thiết bị sắc ký khí (GC/MS) a. Lựa chọn điều kiện trên thiết bị GC-MS a. Lựa chọn điều kiện trên thiết bị GC-MS
- Hệ thống sắc ký khí khối phổ kép Agilent 7890A GC System và 7000 GC/MS Triple Quad với cột sắc ký là TraceTM TR-35MS (30m x 250µm; 0,25µm), tỷ lệ chia dòng 19:1, nhiệt độ inlet: 225°C, khí mang: Heli.
- Điều kiện MS: Chế độ quét: Quét toàn phổ (full scan) trong khoảng 50 – 550 m/z, thế ion hóa: 70 eV, nhiệt độ lò sang cột transferline: 300°C, nhiệt độ nguồn ion: 230°C, nhiệt độ buồng tứ cực: 150°C.
b. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến quá trình tách sắc ký gồm: 0,8 mL/phút, 1,0 mL/phút và 1,2 mL/phút.
c. Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Khảo sát các thể tích 0,5 µL, 1,0 µL và 1,5 µL.
c. Khảo sát chương trình nhiệt độ của lò
Tiến hành nghiên cứu các chương trình sắc ký (gọi tắt là CTSK) sau: + CTSK 1: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 5°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
31
+ CTSK 2: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 8°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
+ CTSK 3: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 12°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
2.4.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết
- Đối với phương pháp chiết lỏng-lỏng, dung môi chiết đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết các chất phân tích ra khỏi hỗn hợp. Tuy nhiên, dung môi được lựa chọn cũng cần thỏa mãn các tiêu chí:
+ Dung môi không hòa tan trong nước.
+ Dung môi ít độc, dễ kiếm (tương đối thông dụng, thường dùng trong các phòng thí nghiệm phân tích).
+ Nhiệt độ sôi thấp (để dễ bay hơi khi đuổi dung môi khỏi dịch chiết). + Dễ phân tách pha khi chiết xuất.
+ Ngoài ra có thể xem xét thêm các yếu tố như an toàn cháy nổ và khả năng gây kích ứng khi người phân tích tiếp xúc.
Với các tiêu chí trên, chúng tiến hành khảo sát các dung môi chiết thông dụng trong phòng thí nghiệm như: ethyl acetate, diethyl ether, chloroform và n-hexane.
Tiến hành:
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Lấy 5 mL dịch lọc mẫu trắng, thêm 0,5 mL hỗn hợp chuẩn ở nồng độ 200 mg/L, điều chỉnh đến pH=11 bằng dung dịch NaOH 1M. Thêm 5 mL dung môi chiết lắc xoáy 3 – 5 phút, ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để tách pha. Dịch chiết thu được cho chảy qua Na2SO4 khan, lấy 1 mL pha hữu cơ, thêm 100 µL hỗn hợp Methanol + HCl 1%. Thổi khô dung môi bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L. Mỗi dung môi làm lặp lại ba lần.
32
- Mẫu chuẩn: Lấy 1 mL hỗn hợp dung dịch chuẩn nồng độ 200 mg/L, thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol.
2.4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường chiết (pH)
Sau khi lựa chọn được dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, sử dụng dung môi đó để khảo sát pH môi trường. Do các cathinone tổng hợp thường ở dạng hydrochloride nên thường được chiết với bazơ để có thể thu được hình dạng pic tốt hơn trong quá trình phân tích GC-MS. Trong nghiên cứu này, khoảng pH = 8 – 12 được lựa chọn khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đối với quá trình chiết. Các giá trị pH trong khoảng này được điều chỉnh bằng cách sử dụng đệm phosphate.
Tiến hành:
- Mẫu trắng thêm chuẩn: Lấy 5 mL dịch lọc mẫu trắng, thêm 0,5 mL hỗn hợp chuẩn ở nồng độ 200 mg/L, điều chỉnh pH đến các giá trị pH=8; pH=9; pH=10; pH=11; pH=12 bằng các dung dịch đệm phosphate. Thêm 5 mL dung môi chiết đã tối ưu được, lắc xoáy 3 – 5 phút, ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để tách pha. Dịch chiết thu được cho chảy qua Na2SO4 khan, lấy 1 mL pha hữu cơ, thêm 100 µL hỗn hợp Methanol + HCl 1%. Thổi khô dung môi bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong Chương 3.
- Mẫu chuẩn: Lấy 1 mL hỗn hợp dung dịch chuẩn nồng độ 200 mg/L, thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol.
2.5. CÁCH TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.5.1. Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
- Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện các chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự,... Trong phép phân tích định tính phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có
33
mặt chất phân tích và âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích.
- Tính chọn lọc là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
- Để xác định được tính đặc hiệu, tính chọn lọc chúng tôi sử dụng phương pháp xác nhận. Cần xác định được thời gian lưu của chất phân tích sao cho:
+ Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích. + Mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất chuẩn.
Ngoài ra cần đáp ứng yêu cầu về số điểm nhận dạng IP. Theo quy định của Hội đồng châu Âu (EC) thì số điểm IP đối với phương pháp GC-MS là 4 [27].
2.5.2. Xây dựng đường chuẩn
Trong phân tích định lượng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính.
Sau khi xác định được khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ chất phân tích vào đại lượng đo (chiều cao píc hoặc diện tích píc) trong khoảng tuyến tính.
Phương trình đường chuẩn dạng y = (a ± t.Sa) + (b ± t.Sb).x Trong đó: b: hệ số góc của đường chuẩn
a: hệ số tự do.
Khoảng tin cậy của b và a được tính là: b ± t. Sb và a ± t. Sa Sa, Sb: sai số của hệ số a và b.
34 Hệ số tương quan: 0,99 ≤ R2 ≤ 1,00.
Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị vào các bình định mức 10 mL hỗn hợp các dung dịch chuẩn của cathinone tổng hợp sao cho nồng độ mỗi cathinone tổng hợp thay đổi từ 10 mg/L, 20 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L và 100 mg/L. Thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol. Phân tích ở điều kiện tối ưu ở mục 3.1. Làm lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ, tính trung bình, kết quả được trình bày ở chương 3.
2.5.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của thiết bị
Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio).
IDL: là nồng độ mà tại đó tín hiệu chất phân tích lớn gấp 3 lần tín hiệu nhiễu đường nền (tức là tỷ lệ S/N » 3).
IQL: là nồng độ mà tại đó tín hiệu chất phân tích lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đường nền (tức là tỷ lệ S/N » 10).
Xác định IDD và IQL bằng cách phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp nhỏ dần đến khi còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ S/N dựa vào phần mềm của thiết bị.
2.5.4. Tính phù hợp của phương pháp
Với mỗi cathinone tổng hợp, tiến hành phân tích lặp lại 6 lần hỗn hợp chuẩn cathinone ở nồng độ thấp (5 mg/L) và đánh giá độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu và tỷ lệ diện tích píc sắc ký (RSD hoặc CV) theo công thức:
!"#% = &'% ="#
+, × 100
SD: Độ lệch chuẩn của kết quả phân tích ở các thí nghiệm độc lập
X.: Giá trị trung bình của các kết quả phân tích Kết quả được trình bày ở chương 3.
35
2.5.5. Độ chụm (độ lặp lại)
Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên hay độ chụm chỉ mức độ dao động (mức độ lặp lại) của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình.
Tiến hành các thí nghiệm độc lập đối với mẫu chuẩn của các cathinone ở ba khoảng nồng độ khác nhau (nồng độ thấp, nồng độ trung bình và nồng độ cao) và đánh giá độ chính xác thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo nồng độ chất phân tích. Kết quả được trình bày ở chương 3.
2.5.6. Hiệu suất thu hồi (độ thu hồi)
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng. Giống với độ chụm,