Giống với tốc độ dòng pha động, thể tích bơm mẫu cũng là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng doãng chân pic, chồng lấn píc. Nếu lượng mẫu bơm vào cột quá lớn dẫn đến hiện tượng doãng chân píc. Nếu lượng mẫu được bơm vào cột quá nhỏ có thể dưới giới hạn phát hiện của máy. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát hỗn hợp chuẩn gồm Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV ở nồng độ 50 mg/L, dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L ở các thể tích tiêm là 0,5 µL, 1,0 µL và 1,5 µL. Kết quả được trình bày tương ứng lần lượt ở Hình 3.4, Hình 3.5 và Hình 3.6. Tương tự khi khảo sát tốc độ dòng pha động, khi thể tích tiêm mẫu tăng từ 0,5 – 1,5 µL, thời gian lưu của các chất thay đổi, ở cả 3 tốc độ dòng pha động đều thu được sắc ký đồ với các pic sắc nét. Tuy nhiên, khi tốc độ dòng 0,5 µL đường nền chưa ổn định, với tốc độ dòng 1,5 µL không có nhiều sai khác nên thể tích tiêm mẫu 1,0 µL được chọn làm giá trị tối ưu.
Hình 3.4. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 0,5 µL
42
Hình 3.5. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 1,0 µL
Hình 3.6. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 1,5 µL 3.1.1.4. Kết quả khảo sát chương trình nhiệt độ của lò
Trong phương pháp sắc ký khí, chương trình nhiệt độ còn gọi là chương trình sắc ký (CTSK), ảnh hưởng nhiều đến quá trình tách chất phân tích. Do vậy tìm được chương trình nhiệt độ phù hợp cho quá trình phân tích là cần thiết.
43
Để tìm được chương trình nhiệt độ tốt nhất, tiến hành nghiên cứu các chương trình sắc ký sau:
+ CTSK 1: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 5°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
+ CTSK 2: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 8°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
+ CTSK 3: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 12°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
- Tiến hành: Phân tích hỗn hợp chuẩn gồm Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV ở nồng độ 50 mg/L, dung dịch nội chuẩn docosane 50 mg/L ở tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 1,0 µL ở các CTSK ở trên. Kết quả được trình bày ở Hình 3.7, Hình 3.8 và Hình 3.9:
Hình 3.7. Kết quả khảo sát CTSK1
44
Hình 3.8. Kết quả khảo sát CTSK2
Hình 3.9. Kết quả khảo sát CTSK3
Đối với phân tích các cathinone: Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV thì cả 3 CTSK đều phù hợp. Tuy nhiên, với định hướng tiếp tục sử dụng để nghiên cứu phân tích đồng thời 19 cathinone tổng hợp chịu sự quản lý của Nhà nước, để phù hợp với yêu cầu của đề tài, nhóm nghiên cứu sử dụng CTSK2 trong các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả xác định độ phân giải RS và phân tích phổ khối của các chất phân tích ở CTSK2 theo công thức:
R+ = 2(t,-− t,.)
w.+ w-
Trong đó: tRA, tRB: Thời gian lưu của chất A và chất B wA, wB: Độ rộng chân píc của chất A và chất B
45
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ phân giải RS ở CTSK tối ưu
Chất phân tích Thời gian lưu (phút) Độ rộng chân píc Độ phân giải RS Mephedrone 12,414 0,159 Alpha-PVP 16,809 0,175 26,3 N-ethylpentylone 18,998 0,162 13,0 Docosane 19,819 0,173 4,9 MDPV 22,166 0,173 13,6
Kết quả phân tích ta nhận thấy, các chất nghiên cứu đều có độ phân giải lớn (RS > 1,5) nên chương trình sắc ký nghiên cứu là phù hợp với yêu cầu định tính và định lượng các cathinone tổng hợp: Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV.
Để phân tích định tính và định lượng chất phân tích bằng phương pháp GC-MS, ngoài yêu cầu về độ phân giải còn phải đáp ứng yêu cầu về số điểm nhận dạng IP. Kết quả phân tích phổ khối được trình bày ở Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.12 và Hình 3.13:
46
Hình 3.10. Phổ khối của Mephedrone so với phổ khối của nó trong thư viện chuẩn
Hình 3.11. Phổ khối của Alpha-PVP so với phổ khối của nó trong thư viện chuẩn
Hình 3.12. Phổ khối của N-ethylpentylone so với phổ khối của nó trong thư viện chuẩn
47
Hình 3.13. Phổ khối của MDPV so với phổ khối của nó trong thư viện chuẩn
Bảng 3.2. Kết quả phân tích phổ khối của các chất phân tích
Chất phân tích Mảnh ion xuất hiện trong mẫu phân tích (m/z) Điểm IP đạt được Mephedrone 42, 51, 58, 65, 77, 91, 105, 119, 147, 162, 177 16,5 Alpha-PVP 42, 55, 69, 77, 126, 188, 200 10,5 N-ethylpentylone 58, 70, 100, 121, 149, 206 9,0 MDPV 42, 55, 65, 84, 126, 149, 164, 232 12,0
Theo quy định của AOAC, để nhận dạng được chất phân tích bằng phương pháp GC-MS cần có tối thiểu 4 điểm IP. Kết quả phân tích phổ khối các chất cathinone tổng hợp: Mephedrone, Alpha-PVP, N-ethylpentylone và MDPV đều có số điểm IP > 4 đáp ứng yêu cầu định tính chất phân tích.
48
Đối với phương pháp sắc ký khí, chất phân tích trước khi đi vào cột tách được chuyển thành dạng hơi nên bị ảnh hưởng nhiều bởi sự bay hơi của các cấu tử có trong mẫu. Do đó, để phương pháp định lượng có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng yêu cầu, chúng tôi sử dụng chất nội chuẩn trong quá trình phân tích. Trong đề tài, chúng tôi sử dụng chất nội chuẩn thường dùng trong phòng thí nghiệm giám định ma túy là docosane trong các nghiên cứu.
Để phân tích định lượng trên thiết bị GC-MS sử dụng chất nội chuẩn, cần xây dựng quan hệ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích píc của chất phân tích so với diện tích píc của chất nội chuẩn và nồng độ chất phân tích. Để tăng độ nhạy của phương pháp có thể dựa vào tỷ lệ diện tích píc của các mảnh ion đặc trưng (mảnh ion có tín hiệu cao và ổn định, các mảnh gạch chân ở bảng trên) so với diện tích píc các mảnh ion đặc trưng của chất nội chuẩn và nồng độ chất phân tích để xác định hàm lượng chất phân tích có trong mẫu.
Điều kiện tối ưu trên thiết bị GC-MS tổng hợp như sau:
- Thiết bị: Hệ thống sắc ký khí khối phổ Agilent 7890N GC-MS/MS - Điều kiện GC:
+ Cột sắc ký: Cột TR - 35MS (30m x 250µm; 0,25µm) + Thể tích tiêm mẫu: 1 µL với tỷ lệ chia dòng 19:1 + Nhiệt độ inlet: 225°C
+ Khí mang: Heli. Tốc độ dòng khí mang: 1,0 mL/phút
+ Chương trình gradient: 90°C (giữ trong 1 phút), tăng đến 280°C với tốc độ 8°C/phút (giữ ở 280°C trong 10 phút).
- Điều kiện MS:
+ Chế độ quét: Quét toàn phổ trong khoảng 50 – 550 m/z + Thế ion hóa: 70 eV
+ Nhiệt độ transferline: 300°C.
+ Nhiệt độ nguồn ion: 230°C, nhiệt độ buồng tứ cực: 150°C
49
+ SIM các mảnh đặc trưng của Mephedrone, Alpha-PVP, N- ethylpentylone và MDPV lần lượt là 58, 126, 100 và 126.
- Sử dụng chất nội chuẩn là docosane.
3.1.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Khảo sát khả năng chiết các cathinone gồm: Mephedrone, Alpha-PVP, N-ethylpentylone và MDPV trên 4 dung môi: ethyl acetate, diethyl ether, chloroform và n-hexanee (Mục 2.4.1.2). Dịch chiết được phân tích trên GC- MS ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 3.1. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.3. Kết quả phân tích ta thấy: Với mỗi dung môi thì hiệu quả chiết khác nhau.
Dung môi n-hexane chiết được các cathinone tổng hợp với nền mẫu khá sạch, tuy nhiên hiệu suất kém.
Với dung môi là diethyl ether, tuy hiệu suất chiết có thể tạm chấp nhận nhưng dung môi lại dễ bay hơi, kết quả có độ lặp lại thấp.
Đối với 2 dung môi là chloroform và ethyl acetate thì đều có thể dùng để chiết các hoạt chất cathinone tổng hợp. Trong đề tài, chúng tôi sử dụng dung môi là ethyl acetate để chiết vì dung môi này nhẹ hơn nước, khi chiết dễ tách pha, lớp dung môi nằm phía trên nên dịch chiết được lấy ra một cách dễ dàng.
3.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường chiết (pH)
Môi trường chiết là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình chiết. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 8 – 12 môi trường chiết theo mục 2.4.1.3 được trình bày ở Bảng 3.4.
Kết quả phân tích được ta thấy, các cathinone nghiên cứu đều cho hiệu suất thu hồi tốt ở pH kiềm. Tuy nhiên, với pH kiềm mạnh (pH > 12) thì tín hiệu phân tích giảm mạnh.
Kết quả cũng chỉ ra rằng, đối với mẫu viên nén không cần chiết lặp cũng có thể đạt được hiệu suất đáp ứng yêu cầu phân tích.
Do đó, khi chiết hoạt chất cathinone tổng hợp trong mẫu nén chúng tôi chiết đơn trong môi trường có pH từ 9 – 11.
50
Như vậy quy trình chiết có thể tóm tắt như sau và cụ thể trong Hình 3.14: Mẫu viên nén được đồng nhất hóa (nghiền thành bột mịn, trộn đều) và hòa tan trong dung dịch HCl 0,1M, siêu âm hòa tan mẫu trong 30 phút. Lọc bỏ phần không tan, thu dịch lọc.
- Thêm dung dịch có pH từ 9 – 11, lắc đều.
- Thêm dung môi ethyl acetate. Lắc xoáy (vortex) trong 3 – 5 phút. Ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để tách pha. Tách lấy pha hữu cơ.
- Dịch chiết thu được cho chảy qua Na2SO4 khan để loại nước, đuổi dung môi bằng cách thổi khí nitơ, thu được cặn chiết dạng bazơ.
- Hòa tan cặn chiết dạng bazơ trong isopropyl alcol (hoặc methanol) + HCl 1% thu được hoạt chất cathinone dạng muối.HCl.
51
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới quá trình chiết
Chất phân tích Tỷ lệ diện tích pic mẫu chuẩn
Dung môi chiết
Chloroform Ethyl acetate Diethyl ether n-hexane
tỷ lệ S pic R% tỷ lệ S pic R% tỷ lệ S pic R% tỷ lệ S pic R% Mephedrone 0,0791 0,0560 70,89 0,0546 69,12 0,0447 56,55 0,0448 56,67 Alpha-PVP 0,3089 0,2147 69,49 0,2338 75,68 0,1876 60,73 0,1598 51,72 N- ethylpentylone 0,1539 0,1010 65,64 0,1100 71,49 0,1101 71,56 0,0695 45,19 MDPV 0,2307 0,1607 69,66 0,1858 80,55 0,1877 81,38 0,1020 44,22 download by : skknchat@gmail.com
52
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH chiết
Chất phân tích Tỷ lệ diện tích pic mẫu chuẩn pH chiết 8 9 10 11 12 Tỷ lệ S pic R% Tỷ lệ S pic R% Tỷ lệ S pic R% Tỷ lệ S pic R% Tỷ lệ S pic R% Mephedrone 0,0791 0,0578 73,07 0,0675 85,39 0,0638 80,65 0,0616 77,94 0,0490 61,94 Alpha-PVP 0,3089 0,2587 83,76 0,2706 87,62 0,2538 82,16 0,2658 86,04 0,2146 69,47 N-ethylpentylone 0,1539 0,1082 70,33 0,1296 84,26 0,1261 81,95 0,1220 79,31 0,1003 65,16 MDPV 0,2307 0,2021 87,61 0,2081 90,20 0,2046 88,72 0,2036 88,29 0,1687 73,16 download by : skknchat@gmail.com
53
Hình 3.14. Sơ đồ chiết hoạt chất cathinone tổng hợp từ mẫu viên nén
Viên nén chứa cathinone tổng hợp
Bột viên
Dịch lọc
Dịch lọc kiềm
Dịch chiết
Cathinone dạng bazơ
1. Đồng nhất hoá mẫu Nghiền thành bột, trộn đều
2. Hoà tan mẫu Thêm HCl 0,1M Lắc siêu âm 30 phút Lọc bỏ phần không tan
3. Kiềm hoá dịch lọc Thêm dung dịch có pH = 9 – 11
4. Chiết Thêm dung môi ethyl acetate (1:1) v/v Lắc vortex 3 – 5 phút
Ly tâm 5 phút với tốc độ 3000 vòng/phút Hút lấy pha hữu cơ
5. Làm khô Lọc qua Na2SO4 khan
Thổi dung môi bằng dòng khí N2
Cathinone dạng HCl
6. Chuyển dạng muối Thêm isopropyl alcol + HCl (4:1) v/v (Hoặc methanol + HCl)
54
3.1.4. Kết quả đánh giá tính đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp
Để xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc của phương pháp tiến hành các thí nghiệm lặp lại sau: Với mỗi cathinone, phân tích tối thiểu 6 lần với mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp (gần IDL) ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở mục 3.1, kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 sau:
Bảng 3.5. Kết quả phân tích độ đặc hiệu, độ chọn lọc của phương pháp
Chất phân tích
Thời gian lưu (tR),
phút Mảnh ion xuất
hiện trong mẫu phân tích (m/z) Điểm IP đạt được Mẫu trắng Mẫu chuẩn Mẫu thêm chuẩn Mephedrone - 12,419 12,418 42, 51, 58, 65, 77, 91, 105, 119, 147, 162, 177 16,5 Alpha-PVP - 16,806 16,808 42, 55, 69, 77, 126, 188, 200 10,5 N- ethylpentylone - 18,994 18,995 58, 70, 100, 121, 149, 206 9,0 MDPV - 22,168 22,168 42, 55, 65, 84, 126, 149, 164, 232 12,0 - Kết quả phân tích ta thấy: trong tất cả các sắc ký đồ của mẫu trắng đều không thu được tín hiệu phân tích chứng tỏ không tìm thấy hoạt chất cathinone trong mẫu trắng. Ngược lại, khi thêm chất chuẩn cathinone vào mẫu trắng trên đều thu được một píc đơn với thời gian lưu xác định; mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn đều có thời gian lưu trùng nhau.
- Theo quy định của AOAC thì 1 ion mẹ được tính là 1 điểm IP, mỗi ion con tạo thành được tính là 1,5 điểm IP. Kết quả trên ta thấy tổng số điểm IP của
55
mỗi chất cathinone nghiên cứu đều ≥ 4, điều này phù hợp với quy định của AOAC đối với phương pháp GC/MS là 4 điểm IP.
Do đó, phương pháp có tính đặc hiệu, tính chọn lọc cao đáp ứng yêu cầu phân tích.
3.2. XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn
- Chuẩn bị vào các bình định mức 10 mL hỗn hợp các dung dịch chuẩn của cathinone tổng hợp sao cho nồng độ mỗi cathinone thay đổi từ 10 mg/L, 20 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L và 100 mg/L. Thêm 0,5 mL dung dịch nội chuẩn docosane 1000 mg/L, định mức thành 10 mL bằng methanol. Phân tích ở điều kiện tối ưu ở mục 3.1. Làm lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ, tính trung bình, kết quả được trình bày ở Bảng 3.6 sau:
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quy trình phân tích bằng phương pháp GC-MS
Nồng độ (mg/L)
Tỷ lệ diện tích píc
Mephedrone Alpha-PVP N-ethylpentylone MDPV
10 0,0325 0,1457 0,0636 0,0930 20 0,0890 0,3120 0,1588 0,2457 50 0,1976 0,6599 0,3590 0,5398 70 0,2687 0,9254 0,5209 0,7577 100 0,3998 1,4095 0,8013 1,2003 download by : skknchat@gmail.com
56
Hình 3.15. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính xác định Mephedrone
Hình 3.16. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính xác định Alpha-PVP
0 20 40 60 80 100 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
Linear Regression for DATA1_B: Y = A + B * X
Parameter Value Error t-Value Prob>|t| --- A -5.5613E-4 0.00716 -0.07763 0.94301 B 0.00396 1.19727E-4 33.08717 <0.0001 --- R R-Square(COD) Adj. R-Square Root-MSE(SD) N --- 0.99863 0.99727 0.99636 0.0088 5 ---