được so sánh ở các nghiệm thức khác nhau.
2.3.7. Phương pháp đánh giá thay đổi hình thái tế bào
Sự thay đổi hình thái tế bào dưới tác động của cao chiết được quan sát dưới kính hiển vi. Các tế bào sau khi xử lý với dịch chiết ở các nồng độ khác nhau trong vòng 24, 48 và 72 giờ được quan sát hình thái dưới kính hiển đảo ngược (Nikon TE-300, Hoa Kỳ)
2.3.8. Phương pháp nhuộm 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Tế bào sau khi được xử lý với cao chiết ở nồng độ và thời gian thích hợp được cố định bằng dung dịch formaldehyde 4% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào được ủ với 1μg/mL dung dịch DAPI trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tế bào được rửa lại bằng dung dịch PBS. Hình thái nhân tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang (Nikon TE-300, Hoa Kỳ).
2.3.9. Phương pháp xác định sự chuyển dịch phân tử PS và apoptosis tế bào bào
Tỉ lệ tế bào apoptosis được xác định bằng bộ kit Annexin V-FITC apoptosis (BD Biosciences, Hoa Kỳ trên hệ thống máy FACS bằng bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào sau khi xử lý với cao tổng hay cao phân đoạn ở nồng độ và thời gian thích hợp được thu nhận và rửa lại 2-3 lần với dung dịch PBS. Tế bào được huyền phù trong 200μl dung dịch đệm 1X (đi kèm theo bộ kit) với mật độ tế bào 1x106 tế bào/ml. Sau đó, mẫu được nhuộm kép với dung dịch Annexin V-FITC (10 μl) và propidium iodide (PI, 10 μl) và lắc đều trong 20 giây ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau 20 phút, 300 μl dung dịch đệm 1X được bổ dung vào mỗi mẫu. Các mẫu tế bào được xác định tỉ lệ apoptosis bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur (BD Biosciences, Hoa Kỳ).
Kết quả được đánh giá thông qua sự phát huỳnh quang của tế bào sau khi nhuộm kép với Annexin V-FITC và PI (được dò ra bởi kênh FL-2). Sự kết hợp giữa Annexin V và PI có thể giúp phân biệt được tế bào apoptosis sớm (Annexin V dương tính, PI âm tính), tế bào apoptosis muộn (Annexin V dương
35
tính, PI dương tính), tế bào necrosis (Annexin V âm tính, PI dương tính) và tế bào sống (Annexin V âm tính, PI âm tính). Tỉ lệ tế bào apoptosis (apoptosis sớm và apoptosis muộn) được định lượng bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur của BD Biosciences.