2.3.1. Phương pháp thu nhận cao chiết cây Lan Kim Tuyến
Ngâm mẫu bột dược liệu trong hai dung môi khác nhau (ethanol và nước) ở nhiệt độ phòng trong 1-2 ngày. Lọc và loại bỏ dung môi bằng hệ thống cô quay chân không tự động (Buchi, Đức) và thu được cao chiết (cân để xác định khối lượng). Hiệu quả tách chiết (Y, %) được xác định dựa vào tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm cô quay so với khối lượng mẫu sử dụng.
Cảm quan về thể chất, màu sắc cao và xác định độ ẩm của cao cũng như thực hiện các phản ứng hóa học để định tính các nhóm chất đại diện và định lượng các hợp chất đại diện nhằm chọn dung môi chiết xuất phù hợp.
2.3.2. Phương pháp phân tích sơ bộ các hợp chất trong cao chiết
Các nhóm chất hóa học thường gặp trong cao chiết được định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (Bảng 2.3). Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của mẫu Bột dược liệu bằng quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) và được cải tiến bởi khoa Dược – Trường ĐH Lạc Hồng.
Bảng 2.3. Các thuốc thử dùng để phân tích sơ bộ thành phần hóa học Nhóm hợp chất Cách thực hiện Phản ứng dương tính
31
Carotenoid Carr – Price H2SO4
Xanh chuyển sang đỏ Xanh dương hay xanh lục Alkaloid Thuốc thử chung
alkaloid
Kết tủa
Courmarin Phát quang / kiềm Phát quang mạnh hơn
Antraglycosid NaOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ
Tanin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen
(polyphenol)
Anthocyanidin HCl/NaOH Đỏ/Xanh
Proanthocyanidin HCl/to Đỏ
Triterpenoid tự do Lierbermann- Burchard
Vòng đỏ nâu tím, lớp trên màu xanh lục
Saponin Lắc mạnh/H2O Bọt bền
Acid hữu cơ Tinh thể Na2CO3 Sủi bọt
Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch
Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát hiện tượng màu sắc trước và sau phản ứng để ghi nhận có hoặc không có các hợp chất tự nhiên trong cao chiết.
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp Chang et al. Xây dựng đường chuẩn flavonoid có nồng độ 0; 20; 40; 60; 80 và 100 μg/mL từ dung dịch chuẩn gốc quercetin 1000 μg/mL (bảo quản ngăn mát 20 oC trong 1 tháng). Lần lượt cho 0,5 mL dung dịch quercetin (nồng độ 0; 20; 40; 60; 80 và 100 μg/mL) vào 1,5 mL MeOH và thực hiện phản ứng trong 5 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,1 mL AlCl3 10% trong 6 phút. Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 mL CH3COOK 1M và 2,8 mL nước cất, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 415 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid trong các mẫu cao chiết.
32
Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự như quercetin. Hàm lượng flavonoid tổng được tính theo công thức: F = c x V/m. Trong đó: F: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g chiết xuất); c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/mL); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).
2.3.4. Phương pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào
Các dòng tế bào ung thư vú MCF7, BT474, nguyên bào sợi người được bảo quản các ống đông lạnh (cryovial). Các ống tế bào được giải đông nhanh ở 37oC trong 2-3 phút. Huyền phù tế bào được chuyển vào ống ly tâm (15 ml) có bổ sung môi trường nuôi cấy DMEM/F12, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Sau đó ly tâm 1500 v/p, loại bỏ dịch nổi và thu lại cặn tế bào ở đáy ống ly tâm. Các dòng tế bào được huyền phù vào môi trường nuôi cấy. Toàn bộ dung dịch tế bào huyền phù được chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm và nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2. Sau 12-24 giờ, môi trường cũ được loại bỏ và môi trường nuôi cấy phục hồi mới với 20% FBS được thay thế. Tế bào tiếp tục được nuôi cấy phục hồi từ 4-7 ngày trước khi chuyển sang giai đoạn tăng sinh.
Tế bào được nuôi cấy tăng sinh với môi trường tăng sinh phù hợp, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Môi trường nuôi cấy tế bào được thay từ 2-3 lần/tuần. Khi tế bào đạt 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tế bào được cấy chuyển bằng Trypsin/EDTA 0,25% theo tỉ lệ 1:3. Sau đó, tế bào tiếp tục được nuôi cấy tăng sinh và thu nhận khi đạt được lượng tế bào cần thiết. Các dòng tế bào được kiểm tra các thông số như tỉ lệ sống chết, khả năng tăng sinh, sự nhiễm khuẩn, nhiễm mycoplasma trước khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5. Phương pháp xác định độc tính tế bào hay ức chế tăng sinh tế bào in vitro vitro
Để đánh giá khả năng gây độc tế bào, bộ kit WST-1 được sử dụng và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, ảnh hưởng của dịch chiết lên hình thái tế bào được kiểm tra khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi (Olympus, Nhật). Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng ở mật độ tế bào 5 x 103
33
tế bào/giếng hoặc 1 x 104 tế bào/giếng (tùy thuộc mỗi dòng tế bào). Sau 8-12 giờ, tế bào bám dính được xử lý với cao tổng hay cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau và được nuôi cấy tiếp trong 24-48 giờ. Nguyên bào sợi được xử lý tương tự và được sử dụng làm đối chứng.
Sau mỗi thời điểm xác định, dung dịch WST-1 (10 µl) được thêm vào mỗi giếng trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng. Mẫu tế bào được trộn đều bằng máy lắc với tốc độ 300-500 v/p trong 30 giây và ủ ở 37°C và 5% CO2. Sau 4 giờ, mẫu được lắc đều trong 20 giây và xác định giá trị OD bằng máy đọc đa chức năng Multimode Plate Readers (Promega, Hoa Kỳ) tại bước sóng 450 nm. Kết quả được xác định thông qua giá trị OD của mỗi mẫu. Giá trị OD được sử dụng để phân tích tỉ lệ tế bào sống hay tỉ lệ ức chế tế bào tăng sinh theo các công thức sau:
Tỉ lệ ức chế (%) = (1 − OD mẫu
OD đối chứng) X 100%
2.3.6. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên sự ức chế hình thành bào lạc của tế bào thành bào lạc của tế bào
Thử nghiệm khả năng hình thành bào lạc (clonogenic assay) dựa trên nguyên tắc hình hành bào lạc của tế bào đơn khi tế bào được nuôi cấy ở mật độ thấp trong môi trường nuôi cấy thích hợp.Tế bào sau khi xử lý với dịch chiết ở các nồng độ khác nhau theo các mốc thời gian được pha loãng tới hạn với mật độ 300-500 tế bào/giếng trên đĩa 6 giếng trong môi trường thích hợp có bổ sung 10% FBS. Môi trường nuôi cấy được thay định kỳ 2-3 ngày/lần. Sự hình thành bào lạc từ các tế bào đơn nuôi cấy được quan sát hằng ngày dưới kính hiển vi.
Sau 10 ngày nuôi cấy, các bào lạc được cố định bằng dung dịch paraformaldehyde 4% trong 30 phút và nhuộm với dung dịch Crystal Violet 0,5% trong 10 phút. Sau đó, các bào lạc được chụp ảnh và xác định số lượng trong mỗi nghiệm thức. Kết quả được đánh giá thông qua số lượng bào lạc được hình thành trên đĩa nuôi cấy. Các bào lạc (từ 50 tế bào trở lên) được ghi nhận sau khi nhuộm với Crystal Violet. Số lượng bào lạc được xác định trong 5
34
mẫu ngẫu nhiên. Từ đó, hiệu quả sống sót của tế bào (hình thành các bào lạc) được so sánh ở các nghiệm thức khác nhau.
2.3.7. Phương pháp đánh giá thay đổi hình thái tế bào
Sự thay đổi hình thái tế bào dưới tác động của cao chiết được quan sát dưới kính hiển vi. Các tế bào sau khi xử lý với dịch chiết ở các nồng độ khác nhau trong vòng 24, 48 và 72 giờ được quan sát hình thái dưới kính hiển đảo ngược (Nikon TE-300, Hoa Kỳ)
2.3.8. Phương pháp nhuộm 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Tế bào sau khi được xử lý với cao chiết ở nồng độ và thời gian thích hợp được cố định bằng dung dịch formaldehyde 4% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Tế bào được ủ với 1μg/mL dung dịch DAPI trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tế bào được rửa lại bằng dung dịch PBS. Hình thái nhân tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang (Nikon TE-300, Hoa Kỳ).
2.3.9. Phương pháp xác định sự chuyển dịch phân tử PS và apoptosis tế bào bào
Tỉ lệ tế bào apoptosis được xác định bằng bộ kit Annexin V-FITC apoptosis (BD Biosciences, Hoa Kỳ trên hệ thống máy FACS bằng bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào sau khi xử lý với cao tổng hay cao phân đoạn ở nồng độ và thời gian thích hợp được thu nhận và rửa lại 2-3 lần với dung dịch PBS. Tế bào được huyền phù trong 200μl dung dịch đệm 1X (đi kèm theo bộ kit) với mật độ tế bào 1x106 tế bào/ml. Sau đó, mẫu được nhuộm kép với dung dịch Annexin V-FITC (10 μl) và propidium iodide (PI, 10 μl) và lắc đều trong 20 giây ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau 20 phút, 300 μl dung dịch đệm 1X được bổ dung vào mỗi mẫu. Các mẫu tế bào được xác định tỉ lệ apoptosis bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur (BD Biosciences, Hoa Kỳ).
Kết quả được đánh giá thông qua sự phát huỳnh quang của tế bào sau khi nhuộm kép với Annexin V-FITC và PI (được dò ra bởi kênh FL-2). Sự kết hợp giữa Annexin V và PI có thể giúp phân biệt được tế bào apoptosis sớm (Annexin V dương tính, PI âm tính), tế bào apoptosis muộn (Annexin V dương
35
tính, PI dương tính), tế bào necrosis (Annexin V âm tính, PI dương tính) và tế bào sống (Annexin V âm tính, PI âm tính). Tỉ lệ tế bào apoptosis (apoptosis sớm và apoptosis muộn) được định lượng bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur của BD Biosciences.
2.3.10. Phân tích thống kê
Các giá trị đạt được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa (*P < 0.05 hoặc **P < 0.01) giữa các giá trị trung bình được đánh giá bằng unpaired Student’s t-test.
36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ-BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN CÁC NHÓM CHẤT TRONG CÂY LAN KIM TUYẾN TRONG CÂY LAN KIM TUYẾN
3.1.1. Kết quả phân tích thử tinh khiết
Xác định độ ẩm
Bảng 3.1. Độ ẩm của mẫu Lan Kim Tuyến
Độ ẩm (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình
13,32 13,35 13,42 12,97 13,27
Nhận xét: Độ ẩm của mẫu thử dược liệu là 13,27%.
Xác định độ tro toàn phần
Bảng 3.2. Tro toàn phần của mẫu thử Lan Kim Tuyến
Độ tro toàn phần (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình
7,05 7,11 7,20 6,76 7,03
Nhận xét: Độ tro toàn phần của mẫu thử dược liệu là 7,03 %.
Bảng 3.3. Số liệu phân tích sơ bộ thử tinh khiết của mẫu thử Lan Kim Tuyến
Lần thực hiện Bì (g) Dược liệu ban đầu (g) Bì + Dược liệu sau sấy
(g) Nước Độ ẩm (%) Bì + Tro (g) Tro (g) Độ tro (%) 1 24,4029 2,0168 26,1509 0,2688 13,32804 24,5261 0,1232 7,05 2 23,8533 2,0234 25,6065 0,2702 13,35376 23,978 0,1247 7,11 3 22,5323 2,0195 24,2806 0,2712 13,42907 22,6581 0,1258 7,20 4 25,8765 2,0153 27,6304 0,2614 12,97077 25,9951 0,1186 6,76 Trung bình 13,27 7,03
37
3.1.2. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học
Thực hiện trên 30 g được liệu, lần lượt chiết kiệt các hoạt chất với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được các dịch chiết tương ứng. Xác định các nhóm hoạt chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Kết quả xác định sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu dược liệu cây Lan Kim Tuyến (Bảng 3.4). Theo kết quả nghiên cứu của He cho thấy Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii có chứa một số hợp chất như p- hydroxybenzaldehyd, axit ferulic, quercetin, daucosterol, cirsilineol được phát hiện thấy cao phân đoạn CHCl3. Trong khi đó, cao phân đoạn Hexan có chứa các hợp chất sorghumol, friedelin, axit palmitic, hỗn hợp 2 sterol (24- isopropenylcholesterol và 26-methylstigmasta-5,22,25,(27) trien-3-beta-ol), sitosterol, stigmasterol, campesterol. Trong đó, sorghumol, friedelin là những hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong một loài thuộc chi Anoectochilus. sp.
[8]. Tương tự, nhóm nghiên cứu cũng phát hiện thấy một số hợp chất flavonoid glucosid mới trong loài này như quercetin-7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]- glucopyranosid, 8-C-p-hydroxybenzylquercetin, isorhamnetin-7-O-β-D- glucopyranosid, isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol-3-O-β-D- glucopyranosid, kaempferol-7-O-β-D-glucopyranosid, 5-hydroxy-3',4',7- trimethoxyflavonol-3-O-β-D-rutinosid, và isorhamnetin-3-O-β-D-rutinosid. Trong các hợp chất nêu trên, quercetin-7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]- glucopyranosid có hoạt tính oxy hóa mạnh nhất [9]. Tương tự như vậy, nghiên cứu của Yang và cs cho thấy 10 đơn chất gồm beta-sitosterol, ferulic acid, oleanolic acid, lanosterol, p-hydroxybenzaldehyde, 3-methoxyl-p- hydroxybenzaldehlde, daucosterol,3',4',7-trimethoxy-3, 5-dihydroxyflavone, isorhamnetin-3-O-beta-D-rutinoside và rutin được phát hiện thấy trong cao chiết nước của cây Lan Kim Tuyến Anoectochilus formosanus [29]. Ngoài ra, nghiên cứu Huang cho thấy hợp chất ergosterol và stigmasterol được phân tách từ loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ. Đây là hai hợp chất sterol chính của loài Lan Kim Tuyến và được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng [30]. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học của cây Lan Kim Tuyến đều phát hiện thấy Lan Kim Tuyến chứa một số nhóm hợp chất chính gồm nhóm alkaloids, flavonoids, terpenoids, glycosides, và steroids [31][32].
38
Như vậy, kết quả đánh giá sơ bộ của nghiên cứu phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó. Trong các nhóm hợp chất có trong dược liệu Lan Kim Tuyến gồm triterpenoid, alkaloid, flavonoid, glycosid, chất khử và acid hữu cơ. Trong đó, nghiên cứu chú ý tới nhóm hợp chất flavonoid và tiến hành nghiên cứu cụ thể nhóm chất này trong các nghiên cứu tiếp theo. Hơn nữa, một số nghiên cứu gần đây khi tiến hành nghiên cứu nhóm hợp chất flavonoid cũng cho thấy một số kết quả đáng chú ý. Nghiên cứu của Budluang cho thấy cao chiết nước cây Lan Kim Tuyến chứa các chất thuộc nhóm axit phenolic như axit vanillic, axit ferulic, axit chlorogenic axit coumaric. Nghiên cứu của Chac và cs cho thấy cây Lan Kim Tuyến chứa 3 đơn chất nhóm flavonoid gồm quercetin, isorhamnetin và axit ferulic với hàm lượng lần lượt là 106,8 µg/ g cao chiết, 187,2 µg/ g cao chiết và 51,9 µg/g cao chiết [33].
39
Bảng 3.4. Bảng phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của mẫu dược liệu cây Lan Kim Tuyến
Nhóm hợp
chất Thuốc thử /phản ứng Phản ứng dương tính
Kết quả định tính trên các cao chiết Cao ether Cao cồn Cao nước
Tinh dầu Bay hơi tới cắn, có mùi thơm – – –
Chất béo Nhỏ dd trên giấy Vết trong mờ – – –
Carotenoid Thuốc thử Carr–Price Xanh chuyển sang đỏ –
(chỉ xanh lục) – –
H2SO4 Xanh dương hay xanh lục ngả
sang xanh dương
–
(chỉ xanh lục) – –
Triterpenoid Lieberman – Burchard Lớp giữa đỏ nâu/tím + + –
Alkaloid
Mayer (Valse–Mayer) Tủa đục – + +
Bouchardat Tủa đục – + +
Dragendoff Tủa đục – + +
Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn – – –
Anthraquinon NaOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ – (màu vàng)
– * (màu cam)
– * (màu cam)
Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ + ++ ++
Glycosid tim Thuốc thử vòng lacton và
đường desoxy – + +
40
*: dịch thủy phân - : Âm tính
+: Dương tính; ++: Dương tính mạnh
Kết luận: Trong dược liệu Lan Kim Tuyến có: triterpenoid, alkaloid, flavonoid, glycosid, chất khử và acid hữu cơ Một chất cho kết quả âm tinh có thể do:
Chất thực sự không có mặt trong cây
Hàm lượng chất quá ít, ngoài giới hạn phát hiện của thuốc thử Bị các chất khác trong dịch chiết làm mờ phản ứng
Do vậy kết quả chỉ mang tính khảo sát đánh giá sơ bộ
Dung dịch gelatin muối Tủa bông trắng – – –
Saponin Lắc mạnh trong nước Bọt bền – – –
Các chất khử Thuốc thử Fehling Tủa đỏ gạch – + ++
Acid hữu cơ NaHCO3 Sủi bọt – – +