CÁ TRA VÀ BÙN AO NUễI TễM
oà oà oà
oàn n Thl Tỏn n Thl TỏThl TỏmThl Tỏmmm1111, , , , Ngd Ngd Ngd Ngdc Anh Huyc Anh Huyc Anh Huyc Anh Huy1111, , , , NguyNguyNguyNguy[[[[n Thn Thn Thl Dun Thl Dul Dul Dungngngng1111, , , , Thành 5t
Thành 5t Thành 5t
Thành 5t2222, Nguy, Nguy, Nguy, Nguy[n Thl M$n[n Thl M$n[n Thl M$n[n Thl M$n2222, Chõu T, Chõu TKn Phỏt, Chõu T, Chõu TKn PhỏtKn PhỏtKn Phỏt3333 TểM T TểM T TểM T TểM T TTTT
Nghiờn c u tWp trung sàng ldc vi khuLn xt lớ ammonium t@ cỏc mru bựn th i trong ch n nuụi. Mru 0Oc thu t5i cỏc khu v#c thu6c TP. H< Chớ Minh, Ti3n Giang và B$n Tre. Nhúm vi khuLn cú kh n ng xt lý ammonium phõn lWp t@ ngu<n bựn th i ch n nuụi heo, bựn ao cỏ tra, bựn ao tụm dao 6ng l`n l0Ot trong kho ng (1,5 — 2,4) x 102 MPN/g; (0,15 — 1,5) x 102 MPN/g và (0,93 — 2,4) x 102 MPN/g. D#a vào \c i(m hỡnh thỏi và sinh húa, ó tuy(n chdn 0Oc 6 ch1ng vi khuLn cú \c i(m giTng Paracoccus và 3 ch1ng giTng Nitrosomonas. BTn ch1ng cú ho5t tớnh xt lý ammonium cao nhKt (120,83 - 123,66 mg/L) sau khi nuụi cKy trong 168 h 0Oc chdn ( th#c hi:n gi i trỡnh t# 16S rRNA. K$t qu gi i trỡnh t# và so sỏnh v*i dv li:u trờn ngõn hàng gen (GenBank) cho thKy: 02 ch1ng S4 và S6 t0_ng <ng v*i Paracoccus communis (99%), ch1ng S9 t0_ng <ng v*i Paracoccus versutus (100%), ch1ng S3 t0_ng <ng v*i Nitrosomonas europaea
(100%). Hai ch1ng S4 và S6 thu6c loài Paracoccus communis ó cho thKy kh n ng xt lớ ammonium lờn $n 74,9% và 76,65%. õy là l`n `u tiờn Paracoccus communis 0Oc phõn lWp t@ bựn th i và 0Oc bỏo cỏo là vi khuLn cú kh n ng xt lớ ammonium.
T TT
T@ khú@ khú@ khúaaaa: @ khú Paracoccus communis, Nitrosomonas europaea, Paracoccus versutus.
1. T V N 2
S# gia t ng dõn sT, cỏc ho5t 6ng s n xuKt và ụ thl húa nh0ng thi$u quy ho5ch và cỏc bi:n phỏp xt lớ làm gia t ng l0Ong chKt th i tr#c ti$p ra ngoài mụi tr09ng gõy nờn tỡnh tr5ng ụ nhi[m ngày càng nghiờm trdng. Hàm l0Ong nit_ trong n0*c th i th09ng hi:n di:n d0*i d5ng cỏc hOp chKt hvu c_ hay ion nh0 NH4-, NO2- và NO3-. S# x th i khụng qua xt lớ drn $n tớch l•y s# khoỏng húa nit_ c1a cỏc hOp chKt hvu c_ d0 th@a làm t ng n<ng 6 nit_ (NH3) gõy suy gi m hàm l0Ong oxi hũa tan c1a ngu<n n0*c. K$ ti$p s n phLm c1a quỏ trỡnh oxi húa ammonium là nitrite (NO2-) gõy 6c cho h: tu`n hoàn h: mi[n dlch c1a 6ng vWt [15]. Ngoài ra, nitrite cú th( chuy(n húa thành nitrosamin, m6t hOp chKt gõy ung th0 [1].
Nhi3u ph0_ng phỏp ó 0Oc ng dFng ( xt lớ ammonia cú trong n0*c nh0ng ph0_ng phỏp sinh hdc 0Oc chỳ ý h_n c [19]. Nhi3u nghiờn c u ó ch=
1
Trung tõm Cụng nghệ Sinh học TP. Hồ Chớ Minh
2 Trường Đại học Cụng nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chớ Trường Đại học Cụng nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chớ Minh 3 Trường Đại học Văn Lang Email: doanthitam88@gmail.com
ra a d5ng và t`m quan trdng c1a cỏc qu`n xó vi sinh vWt trong quỏ trỡnh chuy(n húa nit_ [13], [9].
G`n õy, m6t sT loài vi khuLn dl d0mng nh0
Paracoccus versutus, Alcaligenes faecalis, Acinetobacter calcoaceticus, Thiosphaera pantotropha, Bacillus sp., Microvirgula aerodenitrificans, Pseudomonas stutzeri, Comamonas sp., Diaphorobacter sp. 0Oc mụ t cú kh n ng xt lớ ammonium bcng cỏch chuy(n húa ammonium thành khớ nit_ [10], [18]. Trong khi ú, cỏc vi sinh vWt dl d0mng cú kh n ng chlu 0Oc n<ng 6 cao ammonium và chKt hvu c_ [11]. Vi khuLn húa
t# d0mng Paracoccus sp. và Nitrosomonas sp. cú kh
n ng xt lớ ammonium phõn lWp 0Oc t@ bựn th i ch n nuụi heo, bựn ao nuụi cỏ tra và bựn ao nuụi tụm. Vỡ
vWy, ó ti$n hành “Phõn lWp và lnh danh vi khuLn xt
lớ ammonium t@ bựn th i ch n nuụi heo, bựn ao cỏ tra và bựn ao nuụi tụm”. 2. V$T LI'U VÀ PH NG PHÁP NGHIấN C U 2.1. Nguyờn v 2.1. Nguyờn v 2.1. Nguyờn v 2.1. Nguyờn vWWWWt lit lit li::::uuuu t li
Mru 0Oc thu bcng h: thTng Tng PVC ó ti:t trựng v*i dung dlch c<n 70%. T5i m i ao, mru bựn 0Oc thu p 3 vl trớ: `u ao, giva ao và cuTi ao theo m6t 09ng chộo. ’ m i vl trớ thu kho ng 100 g bựn.
T5i m i ao ch a n0*c th i ch n nuụi heo (HS), ao nuụi cỏ tra (CS) và ao nuụi tụm (TS) mru 0Oc thu t0_ng t# nh0 mru bựn. Mru 0Oc giv l5nh bcng n0*c ỏ và chuy(n v3 phũng thớ nghi:m trong vũng 3 - 5 gi9, b o qu n p 4˚C và xt lý trong vũng 2 gi9. Trờn m i chai thu mru ghi `y 1 thụng tin v3 ngày, thỏng, la i(m thu mru. Ph0_ng phỏp thu mru n3n ỏy [20].
2.2. Ph0_ng ph 2.2. Ph0_ng ph 2.2. Ph0_ng ph
2.2. Ph0_ng phỏp nghiờn cỏp nghiờn cỏp nghiờn cỏp nghiờn c uuuu
2.2.1. Xỏc lnh mWt sT vi khuLn nitrite húa bcng ph0_ng phỏp MPN-Most Probable Number [2]
Mụi tr09ng ammonium-calcium-carbonate (SM1) (g/l): (NH4)2SO4 (0,5 g); K2HPO4 (1 g); FeSO4.7H2O (0,03 g); NaCL (0,3 g); MgSO4.7H2O (0,3 g); CaCO3 (7,5 g) 0Oc st dFng ( phõn lWp vi khuLn Nitrosomonas d#a theo ph0_ng phỏp sT kh hvu (MPN) [2].
ThuTc tht Griess - Ilosway: Dung dlch A: Hoà tan 0,6 g sunfanilic acid trong 10 ml n0*c cKt núng (900°C), ( ngu6i cho thờm 20 ml HCl Wm \c. Pha loóng h n hOp này thành 100 ml v*i n0*c cKt r<i tr6n 3u; dung dlch B: Hoà tan 0,6 g, α-napthylamine trong 10-20 ml HCl Wm \c, pha loóng thành 100 ml v*i n0*c cKt và tr6n 3u; dung dlch C: Hoà tan 16,4 g sodium acetate trong n0*c cKt, pha loóng thành 100 ml v*i n0*c cKt sau ú tr6n 3u. B o qu n riờng bi:t t@ng dung dlch này trong 3 chai tTi, giv trong t1 l5nh, th9i gian st dFng khụng quỏ 1 thỏng.
H n hOp k„m- <ng-manganese dioxide: tr6n 3u 1 g b6t kim lo5i Zn, 1g MnO2 và 1 g b6t kim lo5i Cu.
$m mWt sT Nitrosomonas và Nitrobacter bcng ph0_ng phỏp MPN: $m vi khuLn trong 1 gam mru bựn trong cỏc Tng nghi:m ch a mụi tr09ng trờn (mru bựn 0Oc pha loóng p cỏc n<ng 6 t@ 10-1 $n 10-5, 3 l`n l\p l5i). – cỏc Tng nghi:m p 28○C trong 21 ngày. Tra c u b ng 1-MPN tiờu chuLn ( xỏc lnh sT l0Ong cú th( cú c1a nhúm AOB trong 1 gam mru bựn.
2.2.2. Ph0_ng phỏp lnh l0Ong ammonium
Xỏc lnh hàm l0Ong ammonium (NH4+) bcng mỏy o cỏc ch= tiờu n0*c c`m tay HACH DR 900 theo ph0_ng phỏp Salicylate.
2.2.3. Ki(m tra sinh húa vi khuLn phõn lWp
Vi khuLn 0Oc nuụi cKy trờn mụi tr09ng: Tryptone (10 g/l), yeast extract (5 g/l) và NaCl (5 g/l), pH 7, nhi:t 6 25oC. Cỏc ki(m tra catalase, urease, kht nitrate, phõn gi i tinh b6t, phõn gi i gelatin, chuy(n húa cacbonhydrate bcng ph n ng oxi húa 0Oc th#c hi:n theo ph0_ng phỏp chuLn [8].
2.2.4. K— thuWt PCR
Sau khi tỏch chi$t DNA tNng sT cỏc ch1ng vi khuLn theo kit DNeasyđ Blood & Tissue Handbook, ti$n hành ph n ng khu$ch 5i o5n gen 16S rRNA v*i c\p m<i chuyờn bi:t 0Oc trỡnh bày trong b ng 1. B
B B
B ng 1. C\p primer st dFng trong khuy$ch 5i o5n gen 16S rRNAng 1. C\p primer st dFng trong khuy$ch 5i o5n gen 16S rRNAng 1. C\p primer st dFng trong khuy$ch 5i o5n gen 16S rRNAng 1. C\p primer st dFng trong khuy$ch 5i o5n gen 16S rRNA
Mru M<i Trỡnh t# Tham kh o
357F 5’-CCTACGGGAGGCTGCAG-3’
Nitrosomonas
534R 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ [14]
Thành ph`n ph n ng PCR bao g<m: 12,5 àl Mix PCR, 2,5 àl Mix primer, 2 àl DNA khuLn và bN sung n0*c cKt vụ trựng ( 5t th( tớch ph n ng là 25 àl.
Ph n ng PCR 0Oc th#c hi:n trong mỏy luõn nhi:t theo quy trỡnh sau: Bi$n tớnh genome p 94oC trong 5 phỳt, ti$p $n là 40 chu k~: 94oC/30 giõy, 56oC/30 giõy, 68oC/30 giõy, cuTi cựng là 72oC/10 phỳt.
S n phLm PCR 0Oc ki(m tra bcng i:n di trờn agarose gel 1% bN sung thuTc nhu6m Ethydium Bromide (EtBr) và phõn tớch hỡnh nh i:n di bcng h: thTng Gel Documentation (Bio-Rad).
S n phLm PCR 0Oc gti gi i trỡnh t# vựng 16S rRNA t5i Cụng ty Nam Khoa, Vi:t Nam.
Sau ú dựng cụng cF BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ( so sỏnh và tỡm ki$m nhanh nhvng trỡnh t# t0_ng <ng v*i trỡnh t# c1a t@ng mru kh o sỏt trong ngõn hàng dv li:u gen NCBI (GenBank). St dFng ph`n m3m ClustalX ( so sỏnh m c t0_ng <ng trỡnh t# giva cỏc loài kh o sỏt v*i nhau và v*i trỡnh t# cỏc loài t@ GenBank. Dựng ph`n m3m Mega 5.2 ( xõy d#ng cõy phỏt sinh loài. CuTi cựng d#a vào cõy phỏt sinh loài ( xỏc lnh cỏc mru phõn lWp $n m c loài.