Trong quá trình phân tích mẫu, xử lý mẫu là khâu hết sức quan trọng ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của kết quả phân tích. Xử lý mẫu không triệt để dễ gây mất mẫu, nhiễm bẩn mẫu. Sau đây là một số kĩ thuật chiết mẫu thường được sử dụng trong quá trình chiết tách các chất hữu cơ khó phân huỷ [55].
Chiết lỏng -rắn
Kỹ thuật chiết lỏng - rắn tận dụng sự xoáy trộn của dòng dung môi để gia tăng sự tương tác của nền mẫu với dung môi chiết sử dụng, từ đó chất phân tích có thể được chiết triệt để vào dung môi. Các loại hỗn hợp dung môi thường được sử dụng là axeton, hecxan, diclometan được trộn với các tỉ lệ khác nhau theo thể tích. Mẫu được chiết bằng thiết bị lắc với tốc độ trong khoảng 150 vòng/phút trong khoảng thời gian từ 10 - 12 h. Ưu điểm của phương pháp chiết lỏng - rắn là nhanh, đơn giản dễ thực hiện và cho hiệu quả chiết tốt. Nhược điểm là không thích hợp với một số loại mẫu như mẫu sinh vật.
Kỹ thuật chiết bằng siêu âm
Sử dụng năng lượng của sóng siêu âm được cung cấp từ thiết bị để chiết mẫu cũng hay được áp dụng. Năng lượng của sóng siêu âm có tác dụng phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu, cắt đứt liên kết giữa chất phân tích và nền mẫu, phân bố lại chúng vào dung môi hữu cơ chiết sử dụng. Kĩ thuật chiết này thường áp dụng với một số chất phân tích bền như clobenzen, PCBs, PBDE…và không nên áp dụng với đối tượng như thuốc trừ sâu cơ phot pho, chất hữu cơ dễ bay hơi.
Kỹ thuật chiết Soxhlet hoặc chiết Soxhlet tự động
Dịch chiết sau khi đã chiết bằng phương pháp soxhlet thường không cần sử dụng thêm phương pháp lọc tách nào khác, đặc biệt kỹ thuật này đưa ra độ thu hồi mẫu cao. Mẫu được đưa vào thimble, dưới sự hồi lưu liên tục của dòng dung môi, mẫu sẽ được tách ra khỏi nền mẫu và đi vào hệ dung môi chiết. Dung môi chiết được hóa hơi bằng bếp gia nhiệt và ngưng tụ bằng sinh hàn. Dung môi đi vào thimble là dung môi tinh khiết, nên đảm bảo tách chiết mẫu ra khỏi nền không bị nhiễm bẩn. Phương pháp chiết kiểu này thích hợp với các hợp chất hữu cơ bán bay hơi, dịch chiết thường sạch và hiệu suất chiết đáp ứng được trong khi phân tích các mẫu môi trường.
Trong 3 kỹ thuật chiết mẫu nói trên, kỹ thuật chiết soxhlet cho độ thu hồi cao nhất (> 95 %) phù hợp với mẫu nền phức tạp, nồng độ mẫu thấp. Chiết lỏng - rắn cho độ thu hồi thấp hơn so với kỹ thuật chiết Soxhlet nhưng vẫn đáp ứng được với đối tượng phân tích là mẫu môi trường, độ thu hồi với phương pháp lỏng - rắn là > 80 %. So sánh về thời gian chiết mẫu, chiết siêu âm và chiết shoxlet đều trên 12 tiếng, chiết siêu âm cho khả năng chiết nhanh nhất nhưng hiệu suất thu hồi kém nhất, chỉ nên áp
dụng cho những mẫu có hàm lượng cao. Vì thế trong khuôn khổ luận án này, chọn hai phương pháp xử lý mẫu là chiết soxhlet và chiết lỏng – rắn để nghiên cứu.
Một số phương pháp xử lý mẫu khác như: Phương pháp chiết bằng siêu âm, chiết vi sóng, phương pháp chiết pha rắn và vi chiết pha rắn. Các phương pháp này cho ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, hiệu suất phân tích cao, lượng dung môi chiết sử dụng nhỏ. Tuy nhiên, trên thực tế, các phương pháp chiết này không được sử dụng rộng rãi trong các phòng phân tích do thiết bị chiết rất đắt tiền.
Tùy vào mục đích và điều kiện phòng thí nghiệm mà áp dụng các kỹ thuật chiết phù hợp. Trong đó, phương pháp chiết Soxhlet là phương pháp chiết với hiệu suất khá cao, tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là khá tốn thời gian (khoảng 8-48h) và sử dụng nhiều dung môi tốn kém và gây ảnh hưởng đến môi trường.
Phương pháp chiết lỏng - rắn, trước kia chưa được ưu tiên vì hiệu suất chiết không cao, tuy nhiên gần đây được quan tâm sử dụng vì có ưu điểm là thời gian chiết ngắn và sử dụng ít dung môi hơn, do vậy sẽ có lợi hơn cho môi trường và giá thành cũng giảm hơn.
1.3.2. Các phương pháp làm sạch mẫu trong phân tích CBz
Sau quá trình chiết tách, làm sạch mẫu là bước cần thiết, để loại bỏ các chất ảnh hưởng đến tín hiệu của chất phân tích khi phân tích trên thiết bị sắc kí. Các hợp chất này thường là các chất vô cơ và hữu cơ tự nhiên, kim loại nặng, lưu huỳnh, phthalate esters, nước. Các kỹ thuật sắc ký thẩm thấu gel, kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) với chất hấp phụ như oxit nhôm, florisil, silicagel, cacbon và sắc ký thẩm thấu gel (GPC) thường được sử dụng để loại các chất cản trở và làm sạch chất màu có trong mẫu môi trường với ít chi phí, thời gian ngắn, tăng độ ổn định của phương pháp, giảm độ nhiễu tín hiệu nhiễu của đường nền và cải thiện giới hạn phát hiện của phương pháp [55].
Trong luận án này với đối tượng mẫu chủ yếu là mẫu rắn, đối tượng chất phân tích là các hợp chất nhóm clobenzen có độ phân cực yếu, do vậy kỹ thuật chiết pha rắn được lựa chọn với hai chất hấp phụ là silica gel và florisil trong giai đoạn là sạch mẫu.
Kỹ thuật Chiết pha rắn (SPE)[55]: là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc sắc ký lỏng nhằm loại các ảnh hưởng của nền mẫu hoặc làm giàu đối tượng phân tích trước phân tích.
* Một số loại cột và pha tĩnh thường dùng Thân cột: thường làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo tinh khiết chịu dung môi (polypropylen), có dạng hình trụ
Pha tĩnh: pha tĩnh thường dùng: C18, C8, C4, C2, Cyclohecxan, Phenyl (Pha đảo); Silica, Florisil, Amino, Cyano, Diol, Alumina (Pha thƣờng); SAX (Trao đổi anion); SCX (Trao đổi catrion)
+Silica gel: là một dạng hạt của axit silicic, được sử dụng rộng rãi như một chất
hấp phụ cho các phân tử hữu cơ trong cả pha khí và lỏng để làm sạch và tách phân đoạn các hợp chất hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Cơ chế hấp phụ trên silica gel là thông qua liên kết hidro với các nhóm hydroxyl trong silica. Silica gel có gắn nhóm
OH- sẽ giữ chặt các hợp chất phân cực hơn, trong khi các hợp chất ít phân cực sẽ hơn sẽ chảy dễ dàng qua silica gel. Sự hấp dẫn của các phân tử phân cực đối với silica gel có nhóm OH- là nguyên nhân khiến các thành phần phân cực của hỗn hợp di chuyển chậm qua cột.
+ Florisil: tên thương mại đã đăng ký của Công ty Floridin, là một loại magiê
silicat có tính axit. Nó được sử dụng cho sắc ký cột chung như một quy trình làm sạch trước khi phân tích mẫu bằng sắc ký khí. Florisil cũng là một chất hấp thụ phân cực nhưng yếu hơn silica gel, được sử dụng để chiết xuất các hợp chất phân cực không phân cực đến trung bình từ các dung môi không phân cực.
* Cơ chế chiết
- Hấp phụ (pha thuận): sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. Về cơ bản, sử dụng các điều kiện sắc ký pha thuận. Chất hấp phụ hay đƣợc
dùng nhiều nhất là silicagel, magie silicat (Florisil), nhôm oxit.
- Phân bố trên pha liên kết (pha đảo): bề mặt chất hấp phụ đã thay đổi, được gắn thêm các nhóm chức hóa học khác nhau tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố. Kiểu pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích phân cực, cho phép các chất phân tích không phân cực đi qua cột. Kiểu này thường sử dụng các dung môi ít hoặc không phân cực. Kiểu pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngược lại với kiểu trên, dung môi sử dụng thường có độ phân cực nhất định.
- Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đƣợc gắn với các nhóm chức có thể ion hóa. Cơ chế tách chiết tương tự sắc ký trao đổi ion.
Hình 1.2. Các bước thực hiện của phương pháp SPE
Chọn cột chiết pha rắn: tùy thuộc kiểu chiết mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lƣợng và loại pha tĩnh khác nhau.
Luyện cột: cho dung môi đi qua chất hấp thu để thấm ướt và solvat hóa các nhóm chức, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung môi.
Nạp mẫu vào cột chiết: chuyển mẫu lên cột, sau đó sử dụng áp suất giảm hoặc để mẫu tự chảy.
Rửa loại tạp chất: đây là giai đoạn rửa giải cá tạp chất. Điều quan trọng nhất của quá trình này là chất phân tích không đƣợc tan trong dung dịch rửa.
Rửa giải chọn lọc lấy chất phân tích: việc lưu giữ hoặc rửa giải các tạp chất
và hợp chất quan tâm được kiểm soát bằng cách điều chỉnh độ phân cực của dung môi rửa giải.
Khi phân tích các hợp chất POPs như clobenzen, việc làm sạch mẫu qua cột silica gel hay florisil thường kết hợp thêm một số chất có khả năng loại màu và các hợp chất hữu cơ, mùn có sẵn trong tự nhiên như [55, 56]:
+ Axit sunfuric: khi thêm vào dịch chiết có khả năng phản ứng với các hợp chất
có liên kết đôi, liên kết ba hay vòng thơm tạo ra một hợp chất có cấu trúc chung:
R = R’(pha hữu cơ) + H2SO4 (tan trong nước)
HR – R’HSO4(tan trong nước)
Phản ứng này chuyển đổi nhiều hợp chất có trong dịch chiết mẫu, từ các hợp chất hòa tan hữu cơ thành các hợp chất hòa tan trong nước. Sau khi làm sạch axit sunfuric,
dịch chiết chủ yếu chỉ có hydrocacbon, lưu huỳnh, một số clobenzen sẽ còn lại, dẫn đến dịch chiết mẫu ít bị nhiễm bẩn hơn.
+Than hoạt tính: Diện tích bề mặt bên trong và thể tích lỗ rỗng lớn, khả năng hấp phụ hầu hết các hơi hữu cơ và chi phí thấp làm cho than hoạt tính trở thành một trong những chất hấp phụ được sử dụng phổ biến. Nói chung, carbon hoạt tính rửa giải các hợp chất phân cực đầu tiên, sau đó là các hợp chất không phân cực. Như vậy việc kết hợp cacbon với silica gel với tỷ lệ thích hợp về khối lượng sẽ làm giảm độ phân cực của silicagel, phù hợp cho việc phân tích các hợp chất POPs có mức độ phân cực trung bình đến yếu, đặc biệt là khả năng lọc và loại màu của dịch chiết mẫu [56]
Điều kiện xử lí mẫu khí và mẫu rắn cho phân tích các hợp chất clobenzen tham khảo trong một số tài liệu được đưa ra trong Bảng 1.4
Bảng 1.4. Kỹ thuật xử lý mẫu khí và mẫu rắn cho phân tích CBz
Đối tượng mẫu Điều kiện chiết tách và làm sạch TL
- Lọc bụi được cắt nhỏ cho vào bộ đựng mẫu chiết soxhlet Khí lò đốt nhà với 300 mL toluen trong 16 h, và được chiết làm sạch với
máy luyện thép dung môi diclometan [57]
tại Trung Quốc - Xử lí dung dịch mẫu bằng H2SO4 98%, sau đó làm sạch qua cột cột silicagel đa lớp/alumina
- XAD2 được chiết tách bằng một bộ chiết soxhlet với dung môi toluen, và diethylene glycol. Sau đó dung dịch Khí thải lò đốt được chiết với toluene sau khi thêm 300 mL nước tinh
khiết [58]
rác tại Nhật Bản
- Dịch chiết đã cô chân không được làm sạch bằng axit sunfuric và loại nước bằng Na2SO4 khan, làm sạch bằng cột Sillicagel đa lớp, rửa giải bằng dung môi toluen - Mẫu được chiết soxhlet bằng hỗn hợp aceton : toluen. Khí thải và tro - Xử lí dung dịch mẫu bằng H2SO4 đặc để loại các chất
thải lò đốt rác màu. [59]
Nhật Bản - Dung dịch mẫu sau đó được làm sạch trên cột silicagel
đa lớp/alumina
Khí thải và tro - Mẫu được chiết soxhlet bằng 250 mL toluen trong 24 h, bay nhà máy tái
sau đó cất quay chân không (mẫu tro bay được xử lý trước [60] chế đồng, nhôm
khi chiết soxhlet bằng dung dịch axit HCl 1M và nước) Trung Quốc
Đối tượng mẫu Điều kiện chiết tách và làm sạch TL
- Dịch chiết được chiết lỏng – lỏng với dung môi diclometan.
- Dịch chiết đã cô chân không được làm sạch bằng axit sunfuric và loại nước bằng Na2SO4 khan, làm sạch bằng cột Sillicagel đa lớp /alumina.
- Mẫu được chiết soxhlet bằng 10 mL hỗn hợp aceton : Tro bay lò đốt hecxan (1:4 v/v).
- Dung dịch được cô về 5 mL, xử lí dung dịch mẫu bằng
rác thải [61]
20 mL H2SO4 44%
rắnTrung Quốc
- Dung dịch mẫu sau đó được làm sạch trên cột silicagel
đa lớp (8g silicagel + 3,4g H2SO4 + 4g slicagel tẩm KOH) - Mẫu tro được chiết Soxhlet với dung môi chiết hecxan Tro bay, tro đáy trong 24 giờ
- Dịch chiết đã cô chân không được làm sạch bằng axit
lò đốt rác thải [62]
sunfuric và loại nước bằng Na2SO4 khan, làm sạch bằng rắn
cột Sillicagel đa lớp vơi florisil, rửa giải bằng dung môi
hecxan
- Mẫu đất dược chiết soxhlet với hỗn hợp dung môi
hecxane/acetone (3:1 v/v) trong 8 h ở 60 o
C, làm mát được Mẫu đất trong giữ ở nhiệt độ -10 °C để giảm thiểu tổn thất trong quá trình
nông nghiệp tại chiết [63]
Đức - Dịch chiết được cô cất chân không về 3 - 4 mL, sau đó được làm sạch bằng cột SPE (chứa 2 g florisil), rửa giải với 15-20 mL hecxan
- Mẫu trầm tích ướt được làm khô với Na2SO4, sau đó được chiết với 5 mL hỗn hợp pentane và axeton (4: 1) trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Các chất chiết xuất được làm sạch bằng cách sử dụng một Mẫu trầm tích silicagel với bột đồng hoạt hóa ở lớp trên của cột. Các [64]
chất phân tích được rửa giải với 10 mL pentan; dịch rửa giải được làm bay hơi dưới dòng nitơ đến thể tích khoảng 0,3 mL; 4-bromo, 1-fluorobenzene được thêm vào theo tiêu chuẩn quốc tế
Qua tham khảo tài liệu của các nghiên cứu trước và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, tiến hành nghiên cứu quá trình xử lý mẫu với 2 phương pháp chiết lỏng - rắn và chiết Soxhlet.
1.3.3. Phương pháp sắc kí khí và ứng dụng trong phân tích mẫu môi trường
Các yếu tố cơ bản quyết định phép tách sắc kí các CBz bao gồm: khí mang (loại khí mang, tốc độ khí mang), cột tách (thành phần pha tĩnh, độ phân cực pha tĩnh, bề dày lớp phim pha tĩnh, chiều dài cột tách) và chương trình nhiệt độ cho lò cột.
Loại khí mang được sử dụng phổ biến nhất để tách các CBz là khí Nitơ, độ tinh khiết trên 99,99%; thường được duy trì ở chế độ đẳng dòng với tốc độ dòng qua cột từ 1,0 đến 1,5 mL/phút.
Các CBz được tách trên các loại cột mao quản hở có thành trong phủ pha tĩnh silica biến tính (FS-WCOT); pha tĩnh nhìn chung đều có độ phân cực rất thấp, chủ yếu là loại pha tĩnh có thành phần Poly(5% diphenyl, 95% dimetylsiloxan) (tương ứng với các cột DB-5, DB-5ms, HP-5MS, Rtx-1614) và loại pha tĩnh có thành phần Poly(14% diphenyl, 86% dimetylsiloxan) (tương ứng với cột DB-XLB, Rxi-XLB). Cột DB-5HT, SPB 608 với thành phần pha tĩnh Poly (4% diphenyl, 1% divinyl, 95% dimetylsiloxan) hay cột HT-5 có thành phần pha tĩnh 5% phenyl polycacboran- siloxan cũng được khuyến cáo sử dụng ở nhiệt độ cao. So với các nhóm chất POPs khác, ví dụ như các dioxin và furan cần dùng cột 60 m với lớp phim 0,25 μm; thì chiều dài cột và bề dày lớp phim pha tĩnh trong phép tách các CBz đều hạn chế hơn. Để phân tích được các CBz cần dùng cột có chiều dài 30 m, lớp phim pha tĩnh thường dày 0,25 μm.
Nhiệt độ cổng bơm mẫu phải đủ cao để đảm bảo hóa hơi được toàn bộ mẫu, thông thường nhiệt độ này khoảng 280 oC, có thể đến 300 oC hoặc thậm chí là 340
oC. Đối với các hỗn hợp CBz gồm càng nhiều đồng loại thì chương trình nhiệt độ cho lò cột được chia thành nhiều giai đoạn, tốc độ tăng nhiệt độ của từng giai đoạn phụ thuộc vào thành phần đồng loại của hỗn hợp CBz cần tách. Để phân tích CBz (đặc biệt là các DCB) thì nhiệt độ đầu thường được đặt dưới 100 oC và nhiệt độ cuối