Dịch enzyme thô thu được, ngoài enzyme mong muốn, còn chứa nhiều loại enzyme, protein không hoạt động vác các tạp chất khác. Do đó khâu tiếp theo ở giai đoạn này là phải loại bỏ các enzyme và protein tạp này nếu muốn thu được chỉ duy nhất một enzyme nào đó. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt các phương pháp hóa lý và hóa học khác nhau. Có thể chia thành 3 nhóm phương pháp sau:
Kết tủa
Kết tủa là một trong những biện pháp truyền thống và rẻ tiền nhất để tinh chế enzyme. Để enzyme có thể kết tủa cần thúc đẩy tương tác protein-protein bằng cách
tạo điều kiện dung môi ở trạng thái bão hòa enzyme. Các tác nhân ảnh hưởng tới quá trình kết tủa bao gồm nồng độ muối, loại muối, pH, nhiệt độ, nồng độ và dạng tạp chất. Khuấy trộn và việc đưa vào các tinh thể mầm cũng tác động mạnh tới quá trình kết tủa.
Điện di
Điện di là công nghệ phổ biến để tinh chế protein. Sự gia nhiệt trong quá trình điện di gây ảnh hưởng tới khả năng phân giải là một trở ngại khi nâng lên quy mô công nghiệp. Điện di ở quy mô công nghiệp được thực hiện bằng quá trình liên tục và điện trường được duy trì ổn định bằng phương pháp quay [9; 42].
Sắc ký
Kỹ thuật sắc ký được sử dụng ở quy mô công nghiệp trong tinh chế enzyme từ những năm 1960. Những loại gel sắc ký đầu tiên được sử dụng là Sephadex G-25 và DEAE Sephadex A-50. Những thông số quan trọng trong sắc ký công nghiệp là chiều cao cột, sự tuyến tính của dòng chảy và tỷ lệ giữa dung tích mẫu và dung tích gel. Sự cân đối giữa nhu cầu tăng công suất, tốc độ dòng chảy và độ phân giải cũng cần tìm được công thức phù hợp. Nhằm tránh hiện tượng giảm áp trong cột, hiện nay trong sản xuất công nghiệp các loại cột gián đoạn được sử dụng. Các loại vật liệu như nhựa, thủy tinh hoặc inox đều được ứng dụng trong sắc ký công nghiệp. Các loại cột có thể được kết gắn bằng Viton hoặc Polytetrafuoroethylene (PTFE). Các ống nối có kích thước lớn hơn 4 mm cần được làm bằng thép không gỉ và không có đầu chết nhằm chịu áp và chống nhiễm khuẩn.
Các dạng sắc ký hiện hành bao gồm sắc ký hấp phụ (adsorption), sắc ký phân phối (distribution), sắc ký trao đổi ion (ion exchange), lọc gel (gel filtration), ái lực (affinity), tương tác kỵ nước (hydrophobic), đồng hóa trị (covalent), phức kim loại (metal chelate) [8]. Ngoài những dạng sắc ký dựa trên bản chất của enzyme nguyên gốc, bằng việc tạo ra các enzyme tái tổ hợp người ta có thể đưa thêm các đoạn protein hoặc peptide ngoại lai hỗ trợ tinh chế phổ biến nhất bao gồm glutathione-S- transferase (GST), protein A (SPA), maltose binding protein (MBP), và thioredoxin (TR). Một số đoạn peptide ngắn được đưa vào phục vụ tinh chế chọn lọc bao gồm
poly-histidine, poly-arginine, tryptophan. Xu thế hiện nay là đưa những protein, peptide có kích thước nhỏ hơn để tăng tỷ lệ protein đích. Chế độ rửa giải cho protein cũng là một vấn đề đang được cải tiến nhằm lựa chọn những tác nhân ít độc hại và nồng độ thấp. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp việc loại bỏ các protein/ peptide hỗ trợ cũng cần thiết và phương pháp loại bỏ chúng bằng hóa học hoặc phản ứng enzyme cũng là vấn đề được quan tâm.
CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 30 mẫu rơm rạ, lá cây mục, gỗ mục,…từ các khu vực khác nhau trên các địa bàn: Bắc Ninh, Đắc Lắc, Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên.
2.2. Hóa chất, trang thiết bị máy móc
2.2.1. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và chuyên dụng. Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức), Roth (Đức). Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy Điển, Trung Quốc, Việt Nam.
Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar; Glucose; (NH4)2SO4, K2HPO4.3H2O; KCl; MgSO4.7H2O; FeSO4.7H2O.
Hóa chất dùng cho chiết enzyme và thử hoạt tính: Ammonium sulfate; Urea; Potassium dihydrogen phosphate; Calcium chloride; Magnesium sulfate heptahydrate; Cobalt (II) chloride hexahydrate; Tween 80%; Cacboxymethyl cellulase; Congo red.
Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 Dinitrosalicylic acid; Sodium hydroxide; Sodium potassium tartrate; Phenol tinh thể; Sodium metabisulfite; Citric acid monohydrate; Glucose.
Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide; Tris-base; Ammonium per sulfate; Glycine; Methanol; N’N’-bis-methylene-acrylamide; HCl; Sodium dodecyl sulfate; Acetic acid, Marker protein #26610 (Thermo scientific)
Hóa chất dùng cho tinh chế: Sodium acetate, Sodium chloride, Ammonium sulfate, Ethanol, Acetic acid, Sodium hydroxide, gel DEAE Sepharose™ FF (Pharmacia Biotech), SP Sepharose™ FF (GE), gel Butyl Sepharose High Performance (GE).
Hóa chất dùng cho sinh học phân tử: Enzyme Taq DNA Polymerase 5 U/µl (Qiagen); dNTPs gồm: ATP, TTP, GTP, CTP (Invitrogen); Thang ADN mẫu dùng trong điện di gen (Gibco); Agarose dùng trong điện di DNA (Pharmacia-Biotech); Ethidium bromide dùng để nhuộm gel (Pharmacia-Biotech).
Các mồi dùng trong phản ứng PCR:
MST2: 5′-GACGACGACGACGAC-3′ (Invitrogen)
ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ (Invitrogen)
ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ (Invitrogen)
2.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị máy móc
Máy móc, thiết bị: bộ điện di đứng (Labnet, Clever); box cấy (BioblockScientific, Pháp); cân điện tử (Precisa, Thụy Điển); kính hiển vi quang học (Eclipse E600, Nikon, Nhật); lò vi sóng (LG, Hàn Quốc); máy đo pH (Toledo, Anh); máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức); máy ly tâm cao tốc (Heraeus–Sepatech), máy PCR (C1000 Touch, Biorad); máy soi gel (Syngene); Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật); Tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển); Tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật); máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products); máy Votex, máy spin và máy lắc (Ladnet); bể ổn nhiệt (Giant); máy cô chân không (RVC 2-25, Christ); máy đo OD (Spectro SC, Labo Med); máy sấy đo hàm ẩm (Kern DBS); lò nướng (Goldsun); điện di DNA (Mupid EX, Advance); máy đo hàm lượng protein (Nanodrop 2000, Thermo scientific); hệ thống lọc dòng ngang (Crossflow, Quixstand Benchtopsystem); máy khuấy từ gia nhiệt (IKA CMAG HS7); tủ sấy 70°C (Yanato, Lab-Ware Drying Oven DG 82); tủ sấy vô trùng (Sanyo MOV- 112S), tủ lạnh -30°C (Sanyo); hệ thống tinh chế FPLC (AKTA purifier, GE);…
Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại (20μl-5000μl), ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 100-1000 ml), bình Schott, que cấy, lọc vô trùng 0,45 μm (Sartorius stedim), giấy lọc Whatman, thiết bị chia mẫu với thể tích như nhau (Handy step),....
2.3. Thành phần môi trƣờng dùng trong nghiên cứu
2.3.1. Môi trường phân lập
Môi trường phân lập là môi trường Czapek pH 2,0
Thành phần môi trường (g/l): (NH4)2SO4: 2 g; K2HPO4.3H2O: 1 g; KCl: 0,5 g; MgSO4.7H2O: 0,5 g; FeSO4.7H2O: 0,01 g; Glucose: 20 g; Agar: 20 g.
Chuẩn bị: Cân các thành phần với khối lượng như trên. Chỉnh pH của môi trường bằng HCl 1M.
Tác dụng: môi trường để phân lập nấm mốc chịu acid.
2.3.2. Môi trường làm sạch giống
Môi trường PDA: 20 g agar, 20 g D-glucose trong 1 lít dịch chiết khoai tây.
Dịch chiết khoai tây: 300 g khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch, thái chỉ 5055 mm đun sôi với khoảng 1,5 lít nước RO trong 1giờ, sau đó lọc bỏ bã lấy đúng 1lít dịch chiết. Cho hỗn hợp vào bình Schott sau đó đem khử trùng ở 121C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 70-80C rồi đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô.
Đối với môi trường thạch nghiêng: Quay trong lò vi sóng rồi hút 5ml vào ống nút xoáy 15ml sau đó hấp 1210C trong 15 phút để nghiêng một góc thích hợp sao cho dịch các nghiêng 1/3 chiều dài ống nghiệm. Bảo quản ở 10C.
Tác dụng:
Với đĩa PDA làm môi trường tinh sạch nấm mốc đã được phân lập. Với ống thạch nghiêng dùng để giữ giống.
2.2.3. Môi trường nuôi chiết enzyme
Thành phần môi trường: Cho một bình tam giác 100ml: 1,5 g cám gạo: 1,5 g bã mía: 1,5 g bã malt, dung dịch Mandel: 10 ml.
Maldel (g/l): 2 g (NH4)2SO4, 0,5 g urea, 0,5 g KH2PO4, 0,45 g CaCl2, 0,5 g MgSO.7H2O, 0,05 g CoCl2, 1ml Tween 80%.
Bã mía, bã malt được sấy khô rồi mang nghiền nhỏ như cám gạo, bảo quản tránh ẩm.
Chuẩn bị: Cân theo tỉ lệ và cho vào bình tam giác 100ml, hấp ở 121°C trong 15 phút.
Tác dụng: Dùng làm môi trường nuôi chiết enyme
2.2.4. Môi trường thử hoạt tính enzyme
Môi trường CMC (Cacboxylmethyl Celululose):
Thành phần: 0,5% CMC trong đệm Natri acetate 0,1 M, pH 5; 2% agar
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Hấp môi trường ở 121°C trong thời gian 15 phút.
Để nguội đến 80°C đổ mỗi đĩa hình chữ nhật kích thước 25 cm x 30 cm sao cho mỗi đĩa có chiều dày 0,7 mm. Đục trên mỗi đĩa các lỗ thạch cách đều nhau.
Tác dụng: dùng làm môi trường thử hoạt tính enzyme.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập
Các loại mẫu được lấy ở các địa điểm khác nhau. Các mẫu chứa nấm mốc được pha loãng trong dung dịch NaCl 0,9% pH 2,0. Sau đó nấm mốc được phân lập trên môi trường Czapeck pH 2 có thành phần như đã nêu trong mục 2.3.1.
Quy trình phân lập được tiến hành như sau: Cân 2 g mẫu vào ống Falcon chứa 18 ml dung dịch muối sinh lý pH 2 đã thanh trùng ta được nồng độ pha loãng mẫu là 10-1. Hút 1 ml mẫu ở ống Falcon sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch muối sinh lý pH 2,0 đã thanh trùng ta được nồng độ pha loãng là 10-2. Hút 200 µl mẫu ở nồng độ 10-1, 10-2 nhỏ vào đĩa petri vô trùng sau đó rót môi trường Czapek (đã được làm nóng bằng lò vi sóng và lắc đều) lắc đều rồi chờ cho thạch đông, đem nuôi ở 30°C và 50°C.
2.4.2. Làm sạch giống
Sau khi quan sát các khuẩn lạc trên đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch sẽ có một hoặc nhiều khuẩn lạc mốc khác nhau về hình dạng, màu sắc và kích thước. Lấy mỗi loại một vòng que cấy nấm mốc cần làm sạch và cấy ria lên một đĩa Petri chứa môi trường PDA tương ứng, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 2-3 ngày. Tiến hành làm sạch 2-3 lần đến khi thu được chủng nấm mốc tinh sạch.
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 30°C, sau 2-3 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi có kết nối với máy tính và chụp ảnh lại.
2.4.4.Nuôi chiết enzyme
Tiến hành nuôi chiết enzyme: trước khi nuôi cấy, giống được hoạt hóa ra đĩa PDA ở 30°C trong 3 ngày. Dùng pipet hút 2mml Tween 80 0,05% đã thanh trùng vào mỗi ống giống, dùng que cấy cào sợi nấm trên bề mặt thạch rồi dùng pipet hút toàn bộ dịch vào bình tam giác chứa cơ chất đã chuẩn bị sau đó đảo đều. Đem nuôi 7 ngày ở 30°C, mỗi ngày đảo đều bằng que tre vô trùng. Sau 7 ngày, lấy giống ra bổ sung vào mỗi bình giống 45 ml Natri citrate 0,05M, pH 5,0; lắc 140 vòng/phút ở 30°C trong 2 giờ. Sau khi lắc đem dịch đi ly tâm loại cặn ở 4°C, 9000 vòng/phút trong 10 phút, dịch chiết nấm mốc thu được giữ trong tủ -30°C.
2.4.5. Thử hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ thạch
Mỗi lỗ thạch nhỏ 50 µl enzyme của 1 chủng nấm mốc. Trong đó có 1 đĩa thạch nhỏ 50 µl dịch enzyme Novozyme 500131 1% vào 1 lỗ để làm đối chứng dương, 1 lỗ nhỏ 50 µl nước cất để làm đối chứng âm. Sau khi nhỏ dịch enzyme thì để nguyên vị trí đĩa, không xê dịch hay đặt nghiêng đĩa. Ủ qua đêm ở 50C. Đĩa ủ qua đêm được bổ sung thuốc thử Congo red 0,1%, đổ đều thuốc thử trên bề mặt đĩa thạch, ủ đĩa ở 50C trong 1 giờ. Sau đó đổ thuốc thử ra, rửa nhiều lần bằng nước cất sau đó rửa lại bằng dung dịch NaCl 1M. Đo đường kính vòng thủy phân.
Đường kính của vòng thủy phân = đường kính đo được – 4 mm 4 mm: là đường kính của lỗ thạch được đục.
2.4.6. Xác định hoạt tính cellulase (FPU) bằng DNS ở pH3 và pH5
a. Hóa chất
- Thuốc thử DNS: Nước cất: 708 ml; 3,5 Dinitrosalicylic acid (DNS): 5,3 g; NaOH: 9,9 g. Hòa tan và bổ sung thêm: Rochelle salts (Sodium potassium tartrate):
153 g; Phenol tinh thể (để tan ở 50°C trước khi dùng): 3,8 ml; Sodium metabisulfite (Na2S2O5): 4,15 g.
Kiểm tra lại pH của dung dịch thuốc thử DNS: Lấy 3 ml dung dịch DNS vừa pha, nhỏ phenolphthalein vào dung dịch trên, dung dịch chuyển sang màu đỏ. Nhỏ từng 1 ml HCl 0,1 N vào. Nếu đã nhỏ 3 ml dung dịch HCl 0,1 N vào mà dung dịch không chuyển màu thì dung dịch DNS vừa pha là chuẩn. Nếu lượng HCl 0,1 N dùng ít hơn 3 ml đã làm chuyển màu dung dịch sang màu vàng, thì cứ ít hơn 1ml HCl 0,1 N cần bổ sung vào dung dịch trên 2 g NaOH.
- Đệm Na-citrate 0,05M pH 5,0
b. Xây dựng đường chuẩn glucose
- Cho vào các eppendorf 0,3 ml đường chuẩn
- Bổ sung vào các eppendorf 0,6 ml dung dịch DNS, trộn đều. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0,2 ml dịch phản ứng + 0,9 ml nước cất, trộn đều - Đo 0D ở 540 nm
Dựng được đường chuẩn y = ax + b
Chuẩn bị dung dịch glucose 10 mg/ml, dùng đệm Glycine-HCl 0,05 M pH 3,0 để pha loãng dung dịch glucose khi dựng đường chuẩn ở pH 3,0 và đệm Natri citrate 0,05 M pH 5 để pha loãng dung dịch glucose khi dựng đường chuẩn ở pH 5. Từ đó pha tiếp các nồng độ như 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 mg/ml (Hình 2.1).
Hình 2.1. Đường chuẩn glucose ở pH 3,0 và pH 5,0
c. Phân tích hoạt tính cellulse (FPU) bằng DNS
y = 1.2583x + 0.0392 R² = 0.9974 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.5 1 G lucose , m g/ m l OD 540nm Đƣờng chuẩn glucose pH 3 y = 1.2954x + 0.0117 R² = 0.9972 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.5 1 G lucose , m g/ m l OD 540 nm Đƣờng chuẩn glucose pH 5
Ở pH 3,0
- Cơ chất: 5 miếng giấy lọc được cắt bằng thiết bị đục giấy + 0,2 ml đệm Glycine-HCl 0,05 M pH 2,05 để đảm bảo khi phản ứng giữa enzyme và cơ chất có pH bằng 3,0.
- Enzyme pha loãng ở nồng độ thích hợp
Mẫu thí nghiệm:
1. Cho 0,2 ml đệm Glycine-HCl pH 2,0 + 5 miếng giấy lọc (giữ ở 50°C trong 5 phút)
2. Bổ sung vào eppendorf chứa cơ chất 0,1 ml enzyme, cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút
3. Bổ sung ngay 0,6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
4. Lấy 0,2 ml dịch phản ứng + 0,9 ml nước cất, trộn đều. 5. Đo OD ở bước sóng 540 nm
Mẫu đối chứng: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên ở bước 2: dịch enzyme đã bất hoạt. Lấy 200µl dịch enzyme đem bất hoạt đúng trong 10 phút ở 100°C.
Mẫu blank: Cho vào eppendorf 0,3ml đệm Glycine-HCl 0,05M pH 3. Gia nhiệt ở 50°C/60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3 đến bước 5.
Công thức:
FPU=( )
=( )
Trong đó:
y1: hàm lượng glucose (mg) trong mẫu thí nghiệm y0: hàm lượng glucose (mg) trong mẫu đối chứng x1: độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm
x0: độ hấp phụ của mẫu đối chứng a: hệ số góc của đường thẳng y = ax + b D: hệ số pha loãng
0,18: 180/1000 của đường D-glucose khan 60: thời gian phản ứng (phút)
0,1: số ml enzyme tham gia phản ứng
0,3: tổng thể tích cơ chất + enzyme = 0,3ml đường chuẩn
Định nghĩa: 1 đơn vị FPU: được tính bằng 1 µmol glucose tạo ra khi enzyme thủy phân giấy lọc trong 1 phút ở pH 3, nhiệt độ 50°C.
Ở pH 5,0
Tiến hành giống ở pH 3,0 nhưng khác ở chỗ cơ chất giấy lọc sẽ được ngâm trong 0,2 ml đệm Natri citrate 0,05 M pH 5,0. Phản ứng giữa enzyme và cơ chất có pH là 5,0.
Phản ứng enzyme ở 2 pH khác nhau được tiến hành đồng thời để so sánh tỷ lệ hoạt tính ở pH 3,0 và hoạt tính ở pH 5,0.
2.4.7. Xác định hoạt tính CMCase ở pH 3,0 và pH 5,0
Cơ chất của phản ứng là CMC (Carboxylmethyl cellulose). Ở pH 3,0 CMC được pha cùng với đệm Glycine-HCl 0,05 M sao cho dung dịch cơ chất có pH 2,05 còn ở pH 5,0 CMC được pha với đệm Natri-citrate 0,05M pH 5,0. Các bước tiến hành và công thức tính hoàn toàn giống như phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo FPU.
Định nghĩa: Hoạt tính CMCase (IU/ml): 1 IU được tính bằng 1 µmol glucose