Điện di protein

 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE

Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein

Chuẩn bị mẫu:

Enzyme thô được làm sạch qua cột Hitrap desalting để loại các phân tử có kích thước nhỏ như đường, muối,… Sau khi làm sạch enzyme được trộn với loading dye

STT Hóa chất Gel tách 10 % Gel cô 5 %

1 Nước cất 3 ml 1,385 ml 2 30% Acrylamide 2,5 ml 0,415 ml 3 1,5M Tris-HCl 1,9 ml (pH 8,8) 0,620 ml (pH 6,8) 4 10% SDS 80 µl 25 µl 5 30% APS 15 µl 7,5 µl 6 TEMED 15 µl 7,5 µl

protein theo tỷ lệ 4:1. Lắc đều và gia nhiệt 3 phút ở 100°C sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá.

Chuẩn bị gel:

Sau khi lắp kính thật khít, cài lược vào khuôn và đánh dấu bên ngoài để mép gel cách chân lược khoảng 0,5 cm, đổ lớp running gel đến mức đánh dấu rồi cho ngay 1 lớp nước cất lên bề mặt. Chờ 30 phút để lớp running gel đông, đổ tiếp lớp stacking gel, cài lược, chờ 30 phút để gel đông. Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải đến vạch quy định của thiết bị, gỡ lược, loại bỏ các mẩu gel thừa bên trên giếng nhằm tạo cho giếng sạch khi load mẫu dễ dàng.

Nạp mẫu:

Mẫu đã chuẩn bị ở trên được load (nạp) vào giếng với thể tích thích hợp (khoảng 10 μl mẫu). Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0,5 cm nữa thì dừng máy. Gỡ gel ra cẩn thận tránh bị rách.

Tiến hành nhuộm gel:

- Nhuộm gel trong 50 ml Coomassie brilliant blue ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt màu với protein.

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50 ml. - Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein. Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả.

 Phƣơng pháp điện di Zymogram

Thành phần gel tương tự như ở phương pháp điện di SDS-PAGE nhưng thay nước cất bằng cơ chất CMC 1%.

Tiến hành: Tiến hành tương tự như điện di SDS-PAGE nhưng phần nhuộm gel

thực hiện như sau:

- Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X-100, lắc 30 phút ( 2 lần).

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0,05M Natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15 phút ( 2 lần).

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0,05 M Natri acetate, pH 5,0) ấm, 30 phút ở 50C (hoặc lâu hơn đến 12 giờ).

- Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0,1%, 50°C trong 30 phút đến 1 giờ. - Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200 ml NaCl 1M, rửa 2 lần mỗi lần 15 phút. - Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả.