Nguyên tắc của phương pháp: Mỗi enzyme có một khoảng nồng độ muối mà tại đó enzyme bị kết tủa hoàn toàn, gọi là khoảng nồng độ muối tích. Khoảng nồng độ muối tích của mỗi enzyme thường không giống nhau. Dựa vào cơ sở này chúng tôi tiến hành kết tủa enzyme từ dịch cô đặc bằng muối ammonium sulfate ở các nồng độ khác nhau: 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80% nhằm thu được các phân đoạn kết tủa có thành phần các protein enzyme không giống nhau nhằm tiện cho quá trình tinh chế.
Tiến hành kết tủa phân đoạn enzyme bằng ammonium sulfate ở 10°C từ nồng độ 20%-80%. Các tính toán về khối lượng muối bổ sung dựa vào website: http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm.
Sau kết tủa ở mỗi phân đoạn tiến hành ly tâm ở 4°C, vận tốc 8000 vòng/ phút thu cặn, dịch trong giữ lại để tiếp tục tủa muối đến nồng độ mong muốn. Kết tủa ở mỗi phân đoạn được hòa tan lại bằng đệm Natri-acetate 0,05M pH 5 đến 30ml sau đó bổ sung thêm 10ml dung dịch (NH4) SO 80% bão hòa để được thể tích cuối
cùng thu được ở mỗi phân đoạn là 40 ml và có nồng độ muối như nhau là 20%. Ở mỗi phân đoạn hút ra 1 ml để phân tích hoạt tính enzyme và chạy điện di. Tiếp đó, các mẫu enzyme thu được ở từng phân đoạn được bảo quản trong nồng độ muối 80% bão hòa ở ngăn mát tủ lạnh.
2.4.18.Tinh chế enzyme bằng các phương pháp sắc ký
Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký trao đổi ion trên cột SP Sepharose FF, thể tích cột 6 ml
Ban đầu cột được cân bằng bằng đệm Natri-acetate 20 mM, pH 5,0: 5 CV (5 lần thể tích cột). Rửa phần protein không bám cột gọi là wash out unbound: 2 CV. Mục đích của quá trình rửa này là để loại hết các enzyme không bám cột ra ngoài, những enzyme bám cột sẽ được rửa giải ra sau nhờ sự tăng của nồng độ muối NaCl 1 M. Tiến hành giải hấp phụ (hay rửa giải) bằng dung dịch muối NaCl 1 M pha trong đệm Natri-acetate 20 mM pH 5: 30 CV và nồng độ NaCl 1 M tăng từ 0%-100%. Vận tốc dòng chảy trong hệ thống 1 ml/phút. Mỗi phân đoạn thu 2,5 ml.
- Sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE Sepharose FF, thể tích cột 7 ml
Cột được cân bằng bằng đệm Natri-acetate 20 mM, pH 5,0: 5 CV (5 lần thể tích cột). Wash out unbound: 2 CV. Tiến hành giải hấp phụ (hay rửa giải) bằng dung dịch muối NaCl 1M pha trong đệm Natri-acetate 20 mM pH 5,0: 30 CV và nồng độ NaCl 1 M tăng từ 0%-40%. Vận tốc dòng chảy trong hệ thống 1 ml/phút. Mỗi phân đoạn thu 2,5 ml.
Sắc ký tương tác kỵ nước
Ban đầu cân bằng cột 5 CV bằng dung dịch (NH4)2SO4 2 M pha trong đệm Natri-acetate 20 mM pH 5,0; wash out unbound 2 CV cũng bằng đệm trên. Giảm dần gradient nồng độ muối dịch (NH4)2SO4 2M từ 100%-0% bằng đệm Natri- acetate 20 mM pH 5,0. Quá trình giải hấp phụ được thực hiện trong 20 CV. Vận tốc dòng chảy trong hệ thống là 2 ml/phút. Mỗi phân đoạn thu 3 ml.
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập
Để tìm kiếm nấm mốc sinh enzyme phân hủy lignocellulose chịu pH và chịu nhiệt, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu có bản chất cellulose như rơm rạ, trấu, lá cây, gỗ mục,… giữa các đống ủ phân hữu cơ hoặc bãi rác để tìm các chủng chịu nhiệt. Chúng tôi đã lấy mẫu ở các địa điểm khác nhau trên địa bàn Bắc Ninh, Đắc Lắc, Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Nguyên. Môi trường phân lập là môi trường Czapek cơ bản pH 2 mục đích chọn lọc những loài nấm mốc chịu pH thấp. Môi trường pH thấp như vậy có rất ít vi khuẩn, nấm men có thể phát triển được nên có tác dụng chọn lọc rất tốt. Chúng tôi cũng pha loãng mẫu bằng dung dịch NaCl 0,9% pH 2 để đảm bảo từ đầu đến cuối của quá trình phân lập môi trường đều có pH thấp.
Chúng tôi đã tiến hành phân lập ở pH thấp và nuôi đồng thời ở hai nhiệt độ 30°C và 50°C. Tuy nhiên chỉ những đĩa petri pH 2,0 nuôi ở 30°C có những khuẩn lạc mọc lên, những đĩa nuôi ở 50°C không thấy xuất hiện khuẩn lạc. Có lẽ ở môi trường pH thấp và điều kiện nhiệt độ cao là môi trường khắc nghiệt đối với nấm mốc trong các mẫu phân lập. Ở các đĩa nuôi 30°C, khuẩn lạc nấm mốc mọc trên môi trường Czapek pH 2,0 đường kính khuẩn lạc nhỏ hơn và sô lượng khuẩn lạc ít hơn so với khuẩn lạc ở pH 5,0 (hình 3.1)
Hình 3.1. Hình thái các khuẩn lạc trên môi trường Czapek pH 2 (trái) và pH 5 (phải).
Từ 30 mẫu khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 62 chủng nấm mốc chịu pH thấp. Kết quả thể hiện trong bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc chịu pH phân lập được.
STT Đặc điểm mẫu Địa điểm lấy mẫu
Kí hiệu chủng nấm mốc phân lập đƣợc
1 Rơm mục, đáy đống, màu nâu đen Tiên Du, Bắc Ninh LPH 001, LPH 002
2
Thân gỗ mục, giữa đống ủ, màu xám
Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà Nội
LPH 003, LPH 004, LPH 005, LPH 006
3
Lá cỏ mục, giữa đống ủ, màu xanh đen
Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà Nội
LPH 007, LPH 008, LPH 009, LPH 010
4 Cỏ mục, giữa đống ủ, màu nâu đen
Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội LPH 011, LPH 012
5
Thân mồng tơi mục, giữa đống ủ, màu xanh đen
Lĩnh Nam, Hoàng Mai, Hà
Nội không lấy chủng nào
6
Rơm trồng nấm mỡ đã mục, trên bề
mặt, màu nâu đen Viện di truyền nông nghiệp LPH 013, LPH 014
7
Rơm trồng nấm mỡ đã mục, ở giữa,
màu nâu đen Viện di truyền nông nghiệp
LPH 015, LPH 016, LPH 017, LPH 018
8
Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có
mốc xanh, bề mặt Viện di truyền nông nghiệp LPH 019
9
Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có
mốc trắng, ở giữa Viện di truyền nông nghiệp LPH 020
10
Mùn cưa trong bịch trồng nấm, có
mốc trắng, dưới đáy Viện di truyền nông nghiệp LPH 021
11 Lá mục trong rừng, màu nâu đen Buôn Hồ, Đắc Lắc
LPH 022, LPH 023, LPH 024
12 Cành gỗ mục trong rừng, màu nâu Buôn Hồ, Đắc Lắc
LPH 025, LPH 026, LPH 027
13
Vỏ cà phê mục, giữa đống ủ, màu
nâu Buôn Hồ, Đắc Lắc
LPH 028, LPH 029, LPH 030
14
Mùn cưa mục, giữa đống ủ, màu
đen Trại nấm Yên Nghĩa LPH 031, LPH 032
15 Rơm mục, đáy đống, màu nâu
Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 033, LPH 034, LPH 035
16
Trấu mục được vùi dưới đất, màu nâu đen Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam Định LPH 036, LPH 037, LPH 038 17
Trấu mục + phân gà, giữa đống ủ phân
Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 039, LPH 040, LPH 041, LPH 042
18 Gỗ mục trên cây, màu vàng nâu
Mỹ Hưng, Mỹ Lộc, Nam
Định LPH 043, LPH 044
19 Rơm mục + phân bò, màu đen, ướt
Hưng Lộc, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 045, LPH 046, LPH 047
STT Đặc điểm mẫu Địa điểm lấy mẫu
Kí hiệu chủng nấm mốc phân lập đƣợc
20 Rơm mục, đáy đống, màu đen, ướt
Hưng Lộc, Mỹ Lộc, Nam Định
LPH 048, LPH 049, LPH 050
21 Rơm mục, ướt, màu nâu đen
Yên Giang, Quảng Yên,
Quảng Ninh không lấy chủng nào
22 Rơm mục, màu nâu đen
Hà Nam, Quảng Yên,
Quảng Ninh LPH 051, LPH 052
23
Vỏ trấu + phân gà, màu vàng nâu, tơi xốp
Tân An, Quảng Yên,
Quảng Ninh LPH 053
24
Cành lá mục trong rừng, màu nâu
đen Định Hóa, Thái Nguyên không lấy chủng nào 25 Trấu, giữa đống ủ, màu đen, ướt Chương Mỹ, Hà Nội LPH054, LPH055
26 Cành mục, có mốc trắng, trong rừng Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 056 27 Vỏ gỗ mục, có mốc trắng, trong rừng Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 057 28
Lá thông mục trong rừng thông,
màu nâu đen Đồ Sơn, Hải Phòng
LPH 058, LPH 059, LPH 060
29 Lá mục, màu nâu Đồ Sơn, Hải Phòng không lấy chủng nào 30 Rễ cây mục, màu nâu Đồ Sơn, Hải Phòng LPH 061, LPH 062
Qua bảng ta thấy hầu hết các mẫu phân lập đều có các chủng nấm mốc chịu pH thấp, có những mẫu chúng tôi không lấy chủng nào do có sự trùng lặp nhiều các khuẩn lạc giống nhau về hình thái giữa các mẫu. Các chủng nấm mốc sau khi phân lập sẽ được phân nhóm bằng hình thái tế bào và phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting.
Sau 2-3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C, hình thái các chủng nấm mốc phân hóa khá rõ ràng và đa dạng. Chúng tôi tiến hành phân nhóm sơ bộ các chủng nấm mốc dựa trên 3 đặc điểm cơ bản của khuẩn lạc là : hình dạng, kích thước và màu sắc. Sau đó làm tiêu bản quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon ở vật kính 40x. Hình thái tế bào và bào tử của các chủng nghiên cứu được chụp thông qua camera JVC bằng phần mềm IC capture. Qua quan sát ta thấy, hình dạng và màu sắc khuẩn lạc khá đa dạng: khuẩn lạc xốp, bào tử dễ bay, trên bề mặt khuẩn lạc có vân, hình sợi phân nhánh tạo thành một hệ thống sợi chằng chịt, khuẩn lạc màu xanh, vàng, đen, trắng,…Cuống bào từ đính dạng bình
phân nhánh và không phân nhánh hoặc bào tử đính hình thành những cụm trên những cuống bào tử đính.
LPH 028
LPH 033
LPH 034
3.2. Phân nhóm bằng kĩ thuật fingerprinting
Việc phân loại dựa vào những đặc điểm hình thái khuẩn lạc cũng như tế bào gặp nhiều khó khăn do sự đa dạng và sai khác không rõ ràng giữa các chủng. Để đánh giá tính đa dạng của các chủng chúng tôi đã tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 62 chủng đã phân lập được, sử dụng mồi MST2 .
62 chủng được nuôi cấy trên môi trường PDA trong 2 ngày, tách và tinh chế DNA như mô tả trong phần phương pháp. DNA sau khi tinh chế được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR với chu kỳ gia nhiệt đã nêu ở phần phương pháp. Sản phẩm được điện di trên agarose 1% trong TAE với hiệu điện thế 50V trong 80 phút.
Từ kết quả thể hiện ở phổ fingerprinting, ta thấy sản phẩm PCR nhân với mồi MST2 của các chủng nấm mốc có các phổ băng khác nhau và rất đa dạng do sự phân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí của DNA vệ tinh trong genome. Các chủng có cùng một phổ băng sẽ thuộc cùng một loài, các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc các loài khác nhau tùy theo mức độ khác biệt. Các chủng có cùng phổ băng sẽ được xếp cùng một nhóm. Chúng tôi đã chia 62 chủng nấm mốc thành 35 nhóm. Kết quả được thể hiện trong hình3.3.
Hình 3.3. Phổ fingerprinting của 35 chủng nấm mốc chịu pH thấp. Từ giếng 1-35 tương ứng với các chủng: L1-LPH 002, L2-LPH 005, L3-LPH 006, L4-LPH 007, L5-LPH 010, L6-LPH 014, L7-LPH 015, L8-LPH 018, L9-LPH 019, L10-LPH 021, L11-LPH 022, L12-LPH 024, L13-LPH 025, L14-LPH 026, L15-LPH 028, L16- LPH 031, L17-LPH 032, L18-LPH 033, L19-LPH 034, L20-LPH035, L21-LPH
040, L22-LPH 043, L23-LPH 044, L24-LPH 045, L25-LPH 047, L26-LPH 049, L27-LPH 050, L28-LPH 052, L29-LPH 055, L30-LPH 056, L31-LPH 057, L32- LPH 058, L33-LPH 059, L34-LPH 060, L35-LPH 061, M-Marker.
3.3. Định tên của các chủng nấm mốc dựa vào phƣơng pháp đọc trình tự rDNA
Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting, chúng tôi đã chọn ra 36 chủng đại diện của 35 nhóm để phân tích trình tự. Chúng tôi chọn vùng ITS1-5,8S-ITS2 của rDNA để phân tích. Do kích thước của đoạn ITS1 này khá ngắn (khoảng 600bp), tính bảo thủ rất cao giữa các loài. Đồng thời, trình tự đoạn này của các loài đã biết đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới, nên dễ dàng cho việc so sánh trình tự với các loài mới phân lập được.
Chúng tôi đã tách DNA tổng số của 36 chủng nấm mốc, sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu các đoạn DNA chứa vùng ITS bằng cặp mồi ITS1- ITS4. Sản phẩm PCR được đem đi đọc trình tự với 1 mồi ITS1. Kết quả đọc trình tự sau đó được xử lý bằng phần mềm cho thấy các chủng được đem đi định tên phổ biến thuộc các chi
Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces,… Độ dài của các trình tự và % tương đồng với các chủng trong ngân hàng dữ liệu được trình bày trong phần phụ lục.
Bảng 3.2. Kết quả phân nhóm và tên loài của 35 chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân lignocelluloses bằng PCR fingerprinting và phương pháp đọc trình tự rDNA.
STT Nhóm Chủng Chủng đại diện Tên loài
1 F1 LPH 011, LPH 012, LPH 022, LPH 023, LPH 027, LPH 028, LPH 029, LPH 030 LPH 022, LPH 028 Trichoderma asperellum 2 F2 LPH 036, LPH 037, LPH 057 LPH 057 Trichoderma asperellum 3 F3 LPH 019, LPH 020 LPH 019 Hypocrea lixii 4 F4 LPH 061 LPH 061 Hypocrea lixii 5 F5 LPH 043 LPH 043 Penicillium verruculosum 6 F6 LPH 045 LPH 045 Aspergillus fumigatus 7 F7 LPH 002 LPH 002 Trichoderma asperellum 8 F8 LPH 006 LPH 006 Trichoderma longibrachiatum 9 F9 LPH 021 LPH 021 Trichoderma pleuroticola 10 F10 LPH 025 LPH 025 Schizophyllum commune 11 F11 LPH 059, LPH 062 LPH 059 Chưa xác định
STT Nhóm Chủng Chủng đại diện Tên loài 12 F12 LPH 026 LPH 026 Penicillium sclerotiorum 13 F13 LPH 034 LPH 034 Penicillium simplicissimum 14 F14 LPH 015 LPH 015 Aspergillus nidulans 15 F15 LPH 052 LPH 052 Penicillium sanguineum 16 F16 LPH 009, LPH 013, LPH 038, LPH 039, LPH 046, LPH 051 LPH 013 Aspergillus flavus 17 F17 LPH 014 LPH 014 Aspergillus niger 18 F18 LPH 053 LPH 053 Chưa xác định 19 F19 LPH 005, LPH 041, LPH 054 LPH 005 Aspergillus niger 20 F20 LPH058 LPH058 Aspergillus aculeatus 21 F21 LPH 033 LPH 033 Aspergillus niger 22 F22 LPH 010 LPH 010 Aspergillus tubingensis 23 F23 LPH 042, LPH 050, LPH 048, LPH 003 LPH 050 Aspergillus flavus 24 F24 LPH 004, LPH 017, LPH 035 LPH 035 Penicillium oxalicum 25 F25 LPH 001, LPH 031, LPH 032, LPH 032 Paecilomyces formosus 26 F26 LPH 044 LPH 031 Paecilomyces sinensis 27 F27 LPH 047 LPH 047 Fusarium proliferatum 28 F28 LPH 055 LPH 055 Penicillium chermesinum 29 F29 LPH 007, LPH 008, LPH 016 LPH 007 Aspergillus flavus 30 F30 LPH 060 LPH 060 Penicillium verruculosum 31 F31 LPH 024 LPH 024 Chưa xác định 32 F32 LPH 018 LPH 018 Aspergillus niger 33 F33 LPH 040 LPH 040 Aspergillus sydowii 34 F34 LPH 049 LPH 049 Aspergillus terreus 35 F35 LPH 056 LPH 056 Paecilomyces variotii
Theo các nghiên cứu trên thế giới thì chủng có cùng một phổ sản phẩm PCR khi nhân với mồi MST2 sẽ giống nhau về tên loài khi phân loại bằng phương pháp đọc trình tự 18S rDNA. Các chủng nấm mốc có cùng đặc điểm hình thái và có phổ điện di giống hoặc tương tự nhau thì có thể sẽ thuộc cùng một loài hoặc có họ hàng gần gũi, chẳng hạn hình thái và phổ điện di của các chủng LPH 022, LPH 023, LPH 027, LPH 028, LPH 029 khá giống nhau nên cũng được xếp vào cùng một nhóm. Tuy vậy, để phân loại chính xác các chủng nấm mốc vẫn phải dựa vào việc đọc trình tự rDNA.
3.4. Xác định nồng độ protein, đƣờng kính vòng thủy phân, hoạt tính cellulase, hoạt tính CMCase của các chủng phân lập đƣợc
Nồng độ protein
Việc xác định nồng độ protein của các chủng nấm mốc cho ta biết được hàm lượng protein mà các chủng nấm mốc tiết ra trong môi trường nuôi cấy là nhiều hay ít. Nồng độ protein này không biểu thị tỷ lệ với hoạt tính enzyme của mỗi chủng nấm mốc tương ứng. Có những chủng tiết ra môi trường nhiều protein nhưng hoạt tính enzyme không đáng kể, điều này cho thấy hoạt tính riêng của enzyme thấp. Ngược lại, những chủng tiết ra ít protein nhưng hoạt tính enzyme cao, hoạt tính riêng của enzyme do nấm mốc tiết ra cao. Những chủng như vậy là những chủng rất thuận tiện cho tinh chế do hệ protein tiết ra không quá phức tạp. Nồng độ protein